鴨甲肝病毒VP1蛋白主要抗原域的原核表達(dá)及間接ELISA方法的初步建立

孫 濤，李傳峰，徐 彪，鄧明俊，岳志芹

（1.山東出入境檢驗檢疫局，青島 266002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

鴨甲肝病毒VP1蛋白主要抗原域的原核表達(dá)及間接ELISA方法的初步建立

孫 濤1，李傳峰2，徐 彪1，鄧明俊1，岳志芹1

（1.山東出入境檢驗檢疫局，青島 266002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

根據(jù)已發(fā)表的鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）疫苗株 A66株基因組序列，利用生物學(xué)分析軟件DNAStar進(jìn)行VP1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和抗原域預(yù)測，確定其主要抗原域（major antigen domain of VP1, VP1M），設(shè)計并合成一對可擴增VP1M的特異性引物，PCR擴增獲得長為327 bp的VP1M基因片段。將VP1M基因片段定向克隆至pGEX-4T-1表達(dá)載體中，鑒定正確后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了以包涵體為主的重組蛋白。重組蛋白純化后，經(jīng)過Western blot檢測表明重組蛋白具有良好的抗原性。以該蛋白作為包被抗原，成功建立了檢測DHAV-1的間接ELISA方法。該方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，為DHAV的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查和免疫鴨群的抗體檢測提供了快速實用的檢測手段。

鴨甲肝病毒；VP1；抗原域；間接ELISA

鴨病毒性肝炎（duck viral hepatitis，DVH）是由鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）和/或鴨星狀病毒（Duck astrovirus，DAstV）引起的一種傳播迅速和高度致死性雛鴨傳染病。該病以肝臟腫大和出血為主要病理特征，主要侵害3周齡以內(nèi)的雛鴨，1周齡以內(nèi)雛鴨致死率高達(dá)90%以上，嚴(yán)重制約了現(xiàn)代化養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。DVH最早于1945年發(fā)現(xiàn)于美國，隨后在許多國家相繼報道，呈世界性分布。國內(nèi)，黃均建于1963年首次報道了DVH的發(fā)生和流行。為防止境外DVH傳入中國，農(nóng)業(yè)部和國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局把該病列入了最新版《中華人民共和國進(jìn)境動物檢疫疫病名錄》(聯(lián)合公告第2013號)。

與DAstV比較而言，DHAV是DVH的主要病原，相關(guān)的研究資料也更為詳實。DHAV主要包括血清1、2和3型，分別對應(yīng)DHAV三個不同基因型：A、B和C型[1,2]。血清1型DHAV，也即傳統(tǒng)的血清I型鴨肝炎病毒，在中國乃至世界仍為最主要的流行血清型。血清1型DHAV基因組僅包含1個6750 bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼一條2249 aa的多聚蛋白前體，并最終經(jīng)過蛋白酶水解加工形成3個結(jié)構(gòu)蛋白（VP0、VP3、VP1）和9個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A1、2A2、2A3、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。其中，VP1基因全長714 bp，編碼238個aa的多肽。在小RNA病毒中，VP1蛋白是主要的宿主保護(hù)蛋白，包含了主要的抗原位點并具有主要的型特異性中和位點，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體[3]。因此，VP1蛋白成為近年來的研究熱點。文獻(xiàn)資料顯示，完整的VP1蛋白在大腸桿菌表達(dá)量普遍偏低，有的毒株甚至不表達(dá)。表達(dá)菌篩選、表達(dá)條件的優(yōu)化以及密碼子改造等在提高目的蛋白的表達(dá)量上具有一定的作用[4]。此外，大量研究證明通過選取蛋白主要抗原域進(jìn)行原核表達(dá)，蛋白表達(dá)量會顯著提高，抗原性保留較好而成本明顯降低[5-7]。

本研究通過軟件預(yù)測了DHAV疫苗株 A66株VP1蛋白的主要抗原域，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了高效表達(dá)。在此基礎(chǔ)上初步建立了檢測血清1型DHAV抗體的間接ELISA方法，為進(jìn)一步研制DHAV-VP1抗體診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞和載體DHAV疫苗株 （A66株）由山東出入境檢驗檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品檢測技術(shù)中心禽病實驗室增殖和保存；Trans DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pGEX-4T-1載體購自GE公司。

1.2 血清、抗體和主要試劑血清1型DHAV陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；其他禽病毒血清和兔抗DHAV高免血清均為本禽病實驗室保存；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG購自美國KPL公司；EcoR I、Xho I、T4 DNA連接酶、IPTG 和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；2×Pfu PCR MasterMix購自天根生化科技（北京）有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 DHAV VP1蛋白主要抗原域的預(yù)測首先將DHAV疫苗株A66株 VP1基因的序列翻譯成氨基酸序列，然后應(yīng)用DNAStar Protean軟件模塊進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)和抗原域預(yù)測，分別用Chou-Fasman法和Garnier-Robson法分析VP1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)（α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲），并結(jié)合Karplus-Schultz法預(yù)測VP1蛋白骨架區(qū)的柔韌性；采用Kyte-Doolittle法預(yù)測VP1蛋白的親水區(qū)和疏水區(qū)；用Emini原則預(yù)測特定區(qū)域位于蛋白質(zhì)表面的可能性；綜合應(yīng)用二級結(jié)構(gòu)、柔韌性、親水性和表面可能性4種參數(shù)并結(jié)合Jameson-wolf法預(yù)測的VP1蛋白的抗原指數(shù)來確定主要的抗原域（main antigenic domain，MAD），并命名為VP1M。

1.4 引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中登錄的DHAV疫苗株A66株全基因序列（GenBank登錄號∶DQ886445）以及預(yù)測的主要抗原域VP1M，運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物進(jìn)行擴增。VP1M-F：5'-CGGAATTCACACCACTCAGGCCAA CTC-3'; VP1M-R：5'-CCGCTCGAGTTCAATTTC CAGATCGAGTTC-3'，下劃線部分為EcoR I 和XhoI酶切位點。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 RT-PCR擴增和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)Trizol試劑的使用說明提取200 μL DHAV 雞胚尿囊毒中的總RNA。以提取的總RNA和隨機引物N6或特異性引物VP1M-R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為PCR模板。反轉(zhuǎn)錄程序：42℃反應(yīng)60 min，95℃反應(yīng)5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)采用50 μL反應(yīng)體系：cDNA模板 4 μL、引物（VP1M-F和VP1M-R）各2.5 μL、2×Pfu PCR MasterMix 25 μL、ddH2O 16 μL。反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性5 min；94℃ 變性30 s，52℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，35個循環(huán)；72℃ 延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取6 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。分析正確后，剩余PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。

將回收的PCR產(chǎn)物與載體pGEX-4T-1分別用EcoR I和Xho I雙酶切，用T4 DNA 連接酶于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確后測序進(jìn)一步確證，獲得陽性重組質(zhì)粒，命名為pGEX-4T-VP1M。

1.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定將pGEX-4T-VP1M質(zhì)粒和pGEX-4T-1空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個克隆接入4 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素（Amp+）的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。然后將培養(yǎng)物以1∶100的比例接種到新鮮含Amp+（100μg/mL） LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液D600值達(dá)到0.4～0.8。采用不同誘導(dǎo)時間、不同溫度和不同IPTG誘導(dǎo)濃度進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時設(shè)置空載體誘導(dǎo)對照和重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)對照。不同誘導(dǎo)條件下各取1 mL 誘導(dǎo)產(chǎn)物，12 000×g離心1 min后收集菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，確定最佳誘導(dǎo)時間、溫度和IPTG濃度。以最佳條件誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎細(xì)胞，12 000×g離心15 min, 分別收集上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，鑒定目的蛋白的表達(dá)形式。

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western blot活性檢測經(jīng)過鑒定，目的蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，包涵體蛋白的純化參照文獻(xiàn)[8]，使用包涵體蛋白的分離方法進(jìn)行，純化的目的蛋白濃度用BCA法測定。取純化的目的蛋白與pGEX-4T-1空載體誘導(dǎo)表達(dá)菌經(jīng)變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳4℃封閉過夜后與兔抗DHAV高免血清37℃反應(yīng)2 h，PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 37℃作用2 h，洗滌后，用DAB進(jìn)行顯色。

1.8 間接ELISA檢測方法的建立利用方陣滴定的方法確定最佳的抗原（純化的重組蛋白）包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。首先用抗原包被液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）將抗原分別稀釋至 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/mL，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，4℃包被過夜。用1%明膠溶液37℃封閉1 h。 將除去大腸桿菌非特異性抗體的陽性血清和陰性血清分別按照1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000稀釋，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，37℃作用1 h。PBST洗滌3次后，按照100 μL/孔加入經(jīng)1∶1000～1∶5000系列稀釋的酶標(biāo)二抗，37℃溫育1 h。經(jīng)PBST洗滌后加入TMB底物，37℃孵育15 min，加入2 mol/ L H2SO4溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定OD450吸光度值。P/N的比值最大且P值在1.0左右時的抗原包被濃度和血清稀釋度為最佳工作濃度[9]。按照上述確定的ELISA操作方法檢測30份陰性血清（經(jīng)中和實驗檢測確認(rèn)）。根據(jù)各陰性血清OD450值的平均值（） 和標(biāo)準(zhǔn)方差（s）計算陰陽性樣品的臨界值Cut-off：+3s。

1.9 特異性試驗用建立的間接ELISA方法分別檢測血清1型和3型DHAV陽性血清、鴨瘟病毒（Duck enteritis virus，DEV）陽性血清、禽流感（Avian influenza virus，AIV）陽性血清、番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parovirus，MDPV）陽性血清、鴨呼腸孤病毒（Duck reovirus，DRV）陽性血清和DHAV-1陰性血清。每份血清樣品設(shè)置3個重復(fù)，判定間接ELISA方法的特異性。

1.10 敏感性試驗3份陽性血清經(jīng)1∶40、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120、1∶10 240倍比稀釋后，用建立的間接ELISA方法分別進(jìn)行檢測，確定血清檢出的極限。

1.11 重復(fù)性試驗 批內(nèi)重復(fù)性試驗：選取5份DHAV-1抗體水平不同的血清，在相同的試驗條件下每份血清樣本做5次，根據(jù)變異系數(shù)（CV）來評價批內(nèi)可重復(fù)性。批間重復(fù)性試驗：選取5份DHAV-1抗體水平不同的血清，在相同的試驗條件下的5個不同批次ELISA板中試驗，根據(jù)變異系數(shù)（CV）來評價批間可重復(fù)性。

1.12 臨床樣品的檢測利用建立的間接ELISA方法和經(jīng)典的血清中和試驗對臨床收集的72份疑似鴨甲肝病毒血清進(jìn)行檢測，計算兩種方法檢測的陽性率和符合率。

2 結(jié)果

2.1 VP1主要抗原域的確定DNAStar Protean軟件模塊預(yù)測二級結(jié)構(gòu)和抗原域的結(jié)果如圖1所示。在綜合分析VP1蛋白二級結(jié)構(gòu)、柔韌性、親水性和表面可能性4種參數(shù)以及抗原指數(shù)基礎(chǔ)上，確定了DHAV-1 VP1蛋白主要抗原域在C端的aa130～238，對應(yīng)的VP1M編碼基因長度為327 bp。

圖1 DHAV-1 A66毒株VP1蛋白的二級結(jié)構(gòu)、柔韌性、親水性、表面可能性和抗原指數(shù)Fig.1 Secondary structure, fl exible regions, hydrophilicity plot, surface probability plot and antigenic index of DHAV-1 strain A66 VP1 protein

2.2VP1M基因的RT-PCR和重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 利用特異性引物對DHAV-1 A66毒株的VP1M基因進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，獲得了大小約為327 bp的條帶，與預(yù)期的大小一致（圖2）。重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-VP1M經(jīng)EcoR I 和Xho I雙酶切鑒定，結(jié)果得到約4900 bp和327 bp的2個片段，與預(yù)期的結(jié)果相符（圖2），進(jìn)一步的測序結(jié)果也表明插入目的片段的大小和閱讀框正確。

2.3 重組蛋白的表達(dá)、純化和活性鑒定經(jīng)SDSPAGE電泳確定重組蛋白所表達(dá)的最佳誘導(dǎo)溫度為37℃，IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為1.0 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時間為4 h，所表達(dá)的分子量約為38 kDa，與預(yù)期的大小相符。以最佳條件表達(dá)的重組蛋白是以包涵體的形式表達(dá)，對重組蛋白使用包涵體的分離純化方法進(jìn)行純化，對純化前后的重組蛋白進(jìn)行SDSPAGE檢測，結(jié)果顯示目的蛋白得到了純化（圖3A）。BCA法測定的重組蛋白的濃度為0.802 mg/ mL。Western blot檢測的結(jié)果顯示，純化的目的蛋白在38 kDa大小附近出現(xiàn)特異性條帶，誘導(dǎo)的空載體未出現(xiàn)目的條帶，表明目的蛋白可以被兔抗DHAV-1多克隆血清所識別，具備良好的抗原性（圖3B）。

2.4 DHAV間接ELISA方法的初步建立經(jīng)過方陣滴定試驗確定的重組蛋白包被濃度為2.0 μg/mL，4℃過夜包被，血清稀釋度為1∶100，37℃作用1 h，酶標(biāo)二抗的稀釋度為1∶2000，37℃溫育1 h。其余按照間接ELISA方法進(jìn)行操作。通過測定30份陰性血清樣品確定了平均值()為0.1974，標(biāo)準(zhǔn)差（s）為0.0177。本檢測方法的陰陽性臨界值Cut-off為0.251。

圖2 VP1M基因的RT-PCR和重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4TVP1M的酶切鑒定結(jié)果Fig.2 RT-PCR result of the VP1M gene and identifi cation of recombinant expression plasmid pGEX-4T-VP1M by restriction enzymes digestion

2.5 DHAV間接ELISA方法的評估本研究建立的間接ELISA方法的特異性試驗顯示，只有DHAV-1的陽性血清的OD值超過0.251，表明重組蛋白與其他血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示了良好的特異性。敏感性試驗顯示，當(dāng)血清稀釋至1280倍時檢測結(jié)果仍為陽性，證明該方法具有較好的敏感性。分別用同批次和不同批次的抗原包被酶標(biāo)板以及本研究建立的ELISA方法檢測了5份DHAV-1抗體水平不同的血清，結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)試驗變異系數(shù)（CV）在1.82%～4.11% （表1），批間重復(fù)試驗變異系數(shù)（CV）在6.58%～8.46%（表2），均小于10%，表明該方法具有較好的穩(wěn)定性。

圖3 重組蛋白的SDS-PAGE(A) 和Western blot 分析(B)Fig.3 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of recombinant protein

表1 批內(nèi)重復(fù)試驗Table1 The reproducibility test in the same plates

表2 批間重復(fù)試驗Table2 The reproducibility test in the different plates

2.6 DHAV間接ELISA方法的應(yīng)用和比較將臨床收集的72份疑似鴨甲肝病毒血清用建立的間接ELISA方法和經(jīng)典血清中和試驗（serum-neutralization， SN）進(jìn)行檢測和比較，檢測結(jié)果顯示，與SN相比，建立的ELISA檢測方法的診斷敏感性為91.2%，診斷的特異性為80%，符合率約為88.9%（表3）。

表3 DHAV間接ELISA方法與血清中和試驗的比較Table3 Comparison of the indirect ELISA with SN test for detecting antibody against DHAV

3 討論

隨著現(xiàn)代養(yǎng)鴨業(yè)的規(guī)模化和集約化生產(chǎn)以及國內(nèi)外貿(mào)易的日益頻繁，DVH的危害日益嚴(yán)重。盡管DHAV滅活苗和弱毒苗的研制和應(yīng)用在控制DVH的爆發(fā)和流行上起到了重要的作用，但是近年來DVH發(fā)病率和死亡率還是呈逐年遞增的趨勢。目前，DHAV-1作為DVH的主要病原之一，仍為中國大陸DVH流行主要的致病病原。DVH也是中國進(jìn)出口檢驗檢疫中必檢的一種重要水禽疾病。因此，迫切需要建立一種快速、特異、敏感且可大批量處理樣品的檢測方法，以便能及時正確了解鴨群的免疫抗體水平和疾病感染狀況。

傳統(tǒng)的病毒分離和瓊脂擴散試驗特異性和敏感性較低，而血清中和試驗準(zhǔn)確但費時、費力且不適于大批量樣品的檢測。基于分子生物學(xué)建立起來的檢測技術(shù)主要包括RT-PCR[10, 11]、Real-time RTPCR[12]和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay，RT-LAMP）[13,14]等方法，這些方法是針對病原的檢測，具有較高的特異性和敏感性，但檢測成本和技術(shù)要求較高，也不適宜于活體或大批量樣本的檢測。ELISA方法由于具有快速、特異、敏感和易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，結(jié)合半自動化的檢測設(shè)備，非常適合于大批量樣品的篩查，可滿足基層單位或檢驗檢疫部門的需要。Zhao等[15]將DHAV-1全病毒作為包被抗原建立了檢測抗體的間接ELISA方法。但是DHAV-1的增殖和純化技術(shù)難度大、成本高且易造成散毒。Liu等[16]利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組VP1蛋白也建立了測抗體的間接ELISA方法。該方法與之前ELISA方法相比有較大改進(jìn)，然而DHAV-1 VP1蛋白的表達(dá)量偏低，雖然密碼子優(yōu)化的方法可以提高目的基因的表達(dá)產(chǎn)量[4]，但是密碼子的優(yōu)化需要人工合成堿基序列，這些都增加了抗原制備的成本，不利于試劑盒的研制和推廣應(yīng)用。本研究用DNAStar 生物學(xué)軟件對DHAV-1 VP1基因的二級結(jié)構(gòu)和抗原指數(shù)等特性進(jìn)行分析，選擇主要的抗原域進(jìn)行原核表達(dá)，Western blot檢測表明重組蛋白具有良好的抗原性。以純化后的重組蛋白作為包被抗原而建立的間接ELISA方法具有良好的特異性、敏感性和可重復(fù)性，與中華人民共和國出入境檢查檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的血清中和試驗（SN/T 1418-2004）方法符合率達(dá)到88.9%。本研究利用原核表達(dá)的VP1主要抗原域建立的ELISA方法為進(jìn)一步開發(fā)商品化的ELISA檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

此外，大腸桿菌抗體在鴨群中普遍存在，而本研究建立的ELISA方法包被抗原為大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白，純化后的抗原也或多或少存在大腸桿菌的菌體，這無疑增加了非特異性反應(yīng)，通過將待檢鴨血清預(yù)先吸附大腸桿菌裂解液可明顯降低非特異性反應(yīng)。關(guān)于ELISA檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，一般有兩種評定標(biāo)準(zhǔn)。一種是計算樣本的原始OD平均值和標(biāo)準(zhǔn)差來確定臨界值。另一種是計算待測樣品相對于陽性對照的的比值，通過測定大量樣本效價的頻次分布來確定臨界值和可疑區(qū)間。本研究采用了前者作為陰陽性樣品判臨界值，其依據(jù)的基本原理是當(dāng)樣品的OD值≥陰性樣本OD平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差（+3s）時，在統(tǒng)計學(xué)上可以在99.9%水平上判為陽性。

[1] Fu Y, Pan M, Wang X, et al.Molecular detection and typing of duck hepatitis A virus directly from clinical specimens [J].Vet Microbiol，2008，131(3-4)∶ 247-257.

[2] Wang L, Pan M, Fu Y, et al.Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis [J].Virus Genes, 2008, 37(1)∶ 52-59.

[3] Balamurugan V, Renji R, Saha S N, et al.Protective immune response of the capsid precursor polypeptide (P1) of foot and mouth disease virus type 'O' produced in Pichia pastoris [J].Virus Res, 2003, 92(2)∶ 141-149.

[4] Li C, Chen Z, Meng C, et al.High yield expression of duck hepatitis A virus VP1 protein in Escherichia coli, and production and characterization of polyclonal antibody [J].J Virol Methods, 2013, 191(1)∶ 69-75.

[5] Zhang S, Xiang J, Cheng A et al.Production, purification and characterization of polyclonal antibody against the truncated gK of the duck enteritis virus [J].Virol J, 2010, 7∶ 241.

[6] Liu F, Wu X, Li L, et al.Expression, purification and characterization of two truncated peste des petits ruminants virus matrix proteins in Escherichia coli, and production of polyclonal antibodies against this protein [J].Protein Expr Purif, 2013, 91(1)∶ 1-9.

[7] Li M, Cui W, Mo C, et al.Cloning, expression, purification, antiserum preparation and its characteristics of the truncated UL6 protein of herpes simplex virus 1 [J].Mol Biol Rep, 2014, 41(9)∶ 5997-6002.

[8] Sambrook J, Russell D W.分子克隆實驗指南[M].3版.北京∶ 科學(xué)出版社, 2002∶ 1256-1265.

[9] Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J].Anal Biochem, 1976, 72(7)∶ 248-254.

[10] Kim M C，Kwon Y K，Joh S J, et al.Development of one-step reverse transcriptase-polymerase chain reaction to detect duck hepatitis virus type 1 [J].Avian Dis, 2007, 51(2)∶ 540-545.

[11] Anchun C, Mingshu W, Hongyi X, et al.Development and application of a reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect Chinese isolates of duck hepatitis virus type 1 [J].J Microbiol Methods, 2009, 76(1)∶ 1-5.

[12] Yang M, Cheng, A, Wang, M, et al.Development and application of a one-step real-time Taqman RT-PCR assay for detection of Duck hepatitis virus type1[J].J Virol Methods, 2008, 153(1)∶ 55-60.

[13] Song C, Wan H, Yu S, et al.Rapid detection of duck hepatitis virus type-1 by reverse transcription loopmediated isothermal amplification[J].J Virol Methods, 2012, 182 (1-2)∶ 76-81.

[14] Yang L, Li J, Bi Y, et al.Development and application of a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Duck hepatitis A virus type 1[J].Virus Genes, 2012, 45(3)∶ 585-589.

[15] Zhao X L, Phillips R M, Li G D, et al.Studies on the detection of antibody to duck hepatitis virus by enzymelinked immunosorbent assay [J].Avian Dis, 1991, 35(4)∶778-782.

[16] Liu M，Zhang T, Zhang Y, et al.Development and evaluation of a VP1-ELISA for detection of antibodies to duck hepatitis type 1 virus [J].J Virol Methods, 2010, 169(1)∶ 66-69.

PROKARYOTIC EXPRESSION OF MAJOR ANTIGEN DOMAIN OF VP1 PROTEIN OF DUCK HEPATITIS A VIRUS AND ITS APPLICATION FOR THE DEVELOPMENT OF INDIRECT ELISA

SUN Tao1, LI Chuan-feng2, XU Biao1, DENG Ming-jun1, YUE Zhi-qin1

(1.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The published complete genome sequence of VP1 of Duck hepatitis A virus (DHAV) strain A66 was used to predict its secondary structure and antigen domain and to determine its major antigen domain of VP1 (VP1M) using molecular biological software DNAStar.Accordingly, a pair of specifi c primers were designed and synthesized, which were used for amplifi cation of the VP1M gene fragment with 327 bp in length.The VP1M gene fragment was directly cloned into the expression vector pGEX-4T-1.The resulting pGEX-4T-VP1M plasmid was transformed into BL21 (DE3) and expression of VP1M was induced with IPTG.The recombinant VP1M was harvested in inclusion body form and visualized in Western blot analysis.In addition, an indirect ELISA was developed for detecting antibodies against DHAV-1 using the recombinant VP1M protein.The results showed that the assay was specifi c, sensitive and reproducible, which could be used as a serological method for rapid diagnosis, epidemiology and surveillance of DHAV-1.

Duck hepatitis A virus; VP1; antigen domain; indirect ELISA

S852.659.6

A

1674-6422（2015）02-0007-08

2014-10-20

山東出入境檢驗檢疫局基金項目（SK201301）；青島市公共領(lǐng)域支撐計劃（12-1-3-80-jh）；國家自然科學(xué)基金項目（31101848）

孫濤, 男, 碩士, 獸醫(yī)師, 主要從事動物傳染病病原與生物制品學(xué)研究

徐彪，E-mail∶ xuwenlu@hotmail.com