固相萃取—高效液相色譜—四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測(cè)芥子氣染毒血樣中的三肽加合物

楊柳　劉勤　郭磊　謝劍煒

[摘 要] 三肽加合物，（S-2-羥乙基硫代乙基）-半胱氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸[（S-HETE）-Cys-Pro-Phe]是芥子氣染毒后體內(nèi)重要生物標(biāo)志物之一。本文首先合成并純化（S-HETE）-Cys-Pro-Phe，應(yīng)用固相萃取-高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)其進(jìn)行定性定量分析。將芥子氣染毒血樣經(jīng)Hitrap Blue親和柱提取白蛋白，選擇鏈霉蛋白酶進(jìn)行酶解，應(yīng)用固相萃取柱進(jìn)行富集凈化，采用四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 三肽化合物；固相萃??；高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法

中圖分類號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2015）02-067-03

DOI：10.11876/mimt201502025

芥子氣（mustard gas）是一種糜爛性軍用化學(xué)毒劑，素有“毒劑之王”之稱。芥子氣曾多次應(yīng)用于戰(zhàn)爭(zhēng)中，造成大量人員傷亡，是經(jīng)過“戰(zhàn)爭(zhēng)考驗(yàn)”最有效化學(xué)戰(zhàn)劑之一[1]。對(duì)芥子氣染毒人員進(jìn)行體內(nèi)生物標(biāo)志物檢測(cè)，能夠?yàn)槿径救藛T臨床診斷、鑒定，傷員中毒程度評(píng)估以及實(shí)施及時(shí)、合理救治提供重要技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為闡明芥子氣中毒機(jī)理、研制抗毒藥物提供技術(shù)支持。

芥子氣是一種典型雙功能烴化劑，具有復(fù)雜生物學(xué)作用，可與體內(nèi)許多重要生物大分子，如核酸、蛋白質(zhì)、酶等發(fā)生親核反應(yīng)形成各種加合物[2]。芥子氣進(jìn)入人體后可與血液中人血清白蛋白（HAS）加合，第34位半胱氨酸巰基是其烴化位點(diǎn)之一，在鏈酶蛋白酶水解作用下，該位置半胱氨酸與其后脯氨酸、苯丙氨酸一起形成特征三肽加合物（S-2-羥乙基硫代乙基）-半胱氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸[（S-HETE）-Cys-Pro -Phe]，采用固相萃取進(jìn)行前處理后，可應(yīng)用LC-MS/MS進(jìn)行定性定量分析，其濃度與芥子氣染毒濃度成正比[3]。因此（S-HETE）-Cys-Pro-Phe可以作為芥子氣染毒生物標(biāo)志物開展進(jìn)一步研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200 LC & 6520 Q-TOF MS 四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Agilent，美國）；HiTrap Blue HP親和柱（1mL，GE，美國）；真空固相萃取裝置（Waters，美國）；HLB固相萃取小柱（30 mg，1 mL，Waters，美國）；隔膜泵-離心蒸發(fā)濃縮儀（Labconco，美國）；5418型高速離心機(jī)（Eppendorf，德國）；10 kDa超濾管（Millpore，美國）；LGJ-18C型冷凍干燥機(jī)（四環(huán)科學(xué)儀器廠，中國）；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器（太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，中國）；多肽合成反應(yīng)器（玻璃材質(zhì)，自制）。

芥子氣（購于防化學(xué)院，純度>95%）；人血清白蛋白（Sigma，美國）；鏈酶蛋白酶（Pronase Type XIV from Streptomyces，E.C.3.4.24.31，Sigma，美國）；甲醇、乙腈（Merck，德國）；Wang樹脂（南開大學(xué)化學(xué)系合成）；Fmoc-Pro-Phe-Wang Resin（實(shí)驗(yàn)室自己合成）；N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、1-羥基苯并三氮唑（HOBT）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）均來自蘇州天馬生化公司；半胱氨酸、哌啶、N-N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、三氟乙酸（TFA）、醋酸酐、1，4-二氧六環(huán)、無水硫酸鎂等試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)室用水為：配置溶液所用水為實(shí)驗(yàn)室自制離子交換水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品合成及鑒定

以樹脂F(xiàn)moc-Pro-Phe-Wang Resin為固相載體，以20%哌啶N-N-二甲基甲酰胺混合液為脫保護(hù)劑，以等摩爾N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（0.13 mg）、1-羥基苯并三氮唑（0.36 mg）混合溶液為縮合劑，與實(shí)驗(yàn)室自制半胱氨酸-半芥加合物（S-HETE）-Cys充分混勻后慢速攪拌4h，得到連接在樹脂上目標(biāo)多肽[4-6]：Fmoc-Cys（S-HETE） -Pro-Phe-Wang Resin。

脫去Fmoc保護(hù)后，以三氟乙酸∶水體積比為95∶5 混合液（15 mL）為裂解液，將多肽從樹脂上切割下來，將裂解液倒入冰乙醚（30 mL）中，得到三肽加合物粗品約400 mg，經(jīng)RP-HPLC純化并凍干[5]，得目標(biāo)產(chǎn)物[（S-HETE）-Cys-Pro-Phe]約100 mg左右，產(chǎn)率20%。

應(yīng)用Agilent 1200 LC &6520 Q-TOF MS 四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)（S-HETE）-Cys-Pro-Phe標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定性檢測(cè)。圖1所示為（S-HETE）- Cys-Pro-Phe總離子流圖和選擇離子圖，以及質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜圖。

通過全掃描質(zhì)譜可確定質(zhì)子化分子離子峰[M+H]+ （m/z 470），之后對(duì)分子離子峰[M+H]+進(jìn)行MS/MS質(zhì)譜分析，可確定各個(gè)碎片與該分子結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)，且與文獻(xiàn)值相同[6]，進(jìn)而證明合成所得確為目標(biāo)產(chǎn)物。采用歸一化法分析（S-HETE）-Cys-Pro-Phe標(biāo)準(zhǔn)溶液LC圖，得到面積百分比為96.8%，即合成（S-HETE）-Cys-Pro-Phe純度>96.8%。

圖1 應(yīng)用LC-Q-TOF測(cè)定（S-HETE）-Cys-Pro-Phe色譜、質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜圖

1.3 樣品處理

1.3.1 [（S-HETE）-Cys-Pro -Phe]標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取5 mg[（S-HETE）-Cys-Pro-Phe]標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，加入5 mL含有0.02% TFA 40%乙腈水溶液，定容后標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1 mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)溶液在-4℃條件下可在30天內(nèi)保持穩(wěn)定。將（S-HETE）- Cys-Pro-Phe標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，5μg/mL、10μg/mL，-20℃保存待測(cè)。

1.3.2 （S-HETE）-Cys-Pro-Phe提取[7-8] 采用C18固相萃取法分別從染毒人血清白蛋白樣品和染毒人血樣品中提取三肽加合物（S-HETE）-Cys-Pro-Phe。首先用1 mL甲醇淋洗固相萃取小柱，用1 mL雙蒸水活化30min，將1 mL上述染毒血清白蛋白樣品上柱，用雙蒸水1 mL淋洗，除去雜質(zhì)，再用40%乙腈水溶液3 mL洗脫三肽加合物（S-HETE）-Cys-Pro-Phe。收集洗脫液，以低于60℃溫度離心濃縮除去溶劑，向旋干樣品加入200μL 40%乙腈水溶液，超聲震蕩、待測(cè)。

1.4 樣品分析

色譜條件：日本資生堂公司C18色譜柱（2.0×150mm， 5μm）；流動(dòng)相A：95%水-5%乙腈（內(nèi)含0.01%甲酸銨）；流動(dòng)相B：95%乙腈-5%水（內(nèi)含0.01%甲酸銨）；洗脫程序：0～1 min流動(dòng)相B 10%；1～14 min流動(dòng)相B從10%升至65%；14～15 min流動(dòng)相B從65%升至90%；15～20 min流動(dòng)相B降至10%；流速：0.2 mL/min，進(jìn)樣量：2μL；柱溫：室溫。

質(zhì)譜條件：ESI源：正離子電離，源溫120 ℃，脫溶劑溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓3000 V，MCP 2700 V；EIC Scan m/z =470.1800，（誤差±0.01）。

2 結(jié)果

2.1 （S-HETE）-Cys-Pro-Phe工作曲線繪制

將1.3.1中各濃度（S-HETE）-Cys-Pro-Phe標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.4液相色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行定量測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以（S-HETE）-Cys-Pro-Phe標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，提取離子色譜峰（470.18000）峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖2所示），結(jié)果表明（S-HETE）-Cys-Pro-Phe標(biāo)準(zhǔn)溶液線性范圍為1～50μg/mL，回歸方程為Y=4.797×103+1.568×106X，R=0.9967，檢測(cè)限為2 ng/mL （S/N=3）。

2.2 芥子氣染毒樣本測(cè)定

將1.3.4中提取芥子氣染毒血清及血液樣本，按1.4液相色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行定性、定量測(cè)定。通過從樣品提取離子顯示色譜圖中可檢出其[M+H]峰，證明血清經(jīng)鏈酶蛋白酶酶解，能夠形成（S-HETE）-Cys-Pro-Phe，從而可用做芥子氣染毒血樣定性鑒定。

（S-HETE）-Cys-Pro-Phe離子峰 （470.1800）峰面積與芥子氣染毒濃度呈線性關(guān)系（如圖3所示），回歸方程為Y=1.478×105+6.988×104X，R=0.9969，芥子氣檢出范圍為1～100μmol/L，檢測(cè)限為1μmol/L （S/N=50）。由此可根據(jù)（S-HETE）-Cys-Pro-Phe離子峰面積定量計(jì)算芥子氣染毒濃度。

3 討論

3.1 方法回收率

將芥子氣染毒濃度為50μmol/L血清樣本按1.3.2中所述方法操作，并在質(zhì)譜檢測(cè)前添加等體積10μg/mL濃度（S-HETE）-Cys-Pro-Phe標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)（S-HETE）-Cys-Pro-Phe峰面積比值計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果如圖4所示，根據(jù)回收率=（加標(biāo)試樣測(cè)定值A(chǔ)-試樣測(cè)定值B）/加標(biāo)量C×100%，求得回收率為53%。

a： 芥子氣染毒血清樣本總離子流圖

b： 添加（S-HETE）-Cys-Pro-Phe標(biāo)液后染毒血清樣本總離子流圖

c： （S-HETE）-Cys-Pro-Phe標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖

3.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

考察4種從芥子氣染毒血液樣本中提取白蛋白不同方法，分別是乙腈沉淀白蛋白法、白蛋白鹽析法、固相萃取法和HiTrap Blue HP親和柱法，結(jié)果表明使用HiTrap Blue HP親和柱從全血中提取血清、再經(jīng)過固相萃取方法提取效率最好。

固相萃取過程考察不同濃度乙腈溶液對(duì)萃取效率影響，以及TFA加入對(duì)萃取效果影響，確定最終萃取條件為首先用純水淋洗，除去雜質(zhì)，再用40%乙腈洗脫方法。洗脫液中添加TFA，會(huì)使得淋洗時(shí)損失較多（S-HETE）-Cys-Pro-Phe，故而采取乙腈水溶液為萃取洗脫液。

雖然鏈酶蛋白酶推薦條件為pH=8～9，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)體系pH值對(duì)（S-HETE）-Cys-Pro-Phe影響不顯著，故反應(yīng)體系選擇在中性條件下進(jìn)行。

4 結(jié)論

本文應(yīng)用固相萃取-高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法建立芥子氣染毒血樣中生物標(biāo)志物（S-HETE）-Cys-Pro-Phe分析檢測(cè)方法，可應(yīng)用于芥子氣染毒血液樣本定性、定量分析，結(jié)果較為準(zhǔn)確、耗時(shí)較短、檢測(cè)限較低。

參 考 文 獻(xiàn)

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