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    牛分枝桿菌蛋白基因相互作用研究工具及其進(jìn)展

    2015-11-02 08:50:39張喜悅范偉興
    中國(guó)動(dòng)物檢疫 2015年9期
    關(guān)鍵詞:感受態(tài)潮霉素雙雜交

    張喜悅,史 揚(yáng),范偉興

    (1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032;2.青島市黃島區(qū)畜牧獸醫(yī)局,山東青島 266032)

    牛分枝桿菌蛋白基因相互作用研究工具及其進(jìn)展

    張喜悅1,史揚(yáng)2,范偉興1

    (1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島266032;2.青島市黃島區(qū)畜牧獸醫(yī)局,山東青島266032)

    目前有多種技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌蛋白相互作用的研究:一是酵母雙雜交技術(shù),可以在生物體內(nèi)驗(yàn)證2個(gè)蛋白的相互作用。二是構(gòu)建分枝桿菌基因突變株,研究蛋白作用的機(jī)理,其基本策略為,基因敲除雙鏈DNA的擴(kuò)增;牛結(jié)核分枝桿菌/pJV53感受態(tài)細(xì)胞的制備;將基因敲除雙鏈DNA片段轉(zhuǎn)化至牛結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞中;篩選、鑒定陽(yáng)性菌落。三是通過(guò)GST pull-down試驗(yàn)檢測(cè)已知蛋白和靶蛋白的相互作用。目前,研究牛分枝桿菌蛋白基因相互作用較多是RD1 區(qū)基因。研究表明,闡明分枝桿菌蛋白的作用機(jī)理有助于進(jìn)一步研發(fā)高效的牛結(jié)核病診斷試劑和疫苗。

    牛結(jié)核分枝桿菌;蛋白;相互作用

    牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)是牛結(jié)核病的主要病原,除感染人外,還可感染50 多種哺乳動(dòng)物和 25 種禽類[1]。1998年,第一個(gè)分枝桿菌的全基因組一一MtbH37Rv在《Nature》雜志上發(fā)布[2],標(biāo)志著分枝桿菌的研究進(jìn)入了基因組學(xué)時(shí)代。2003年,牛型分枝桿菌(M.bovis) AF2122/97的基因組序列公布,與結(jié)核分枝桿菌相比,其基因組在核酸水平上有超過(guò)99.95%的同源性[3]。值得注意的是,相比于MtbH37Rv,M. bovis沒有特異的基因,揭示了結(jié)核病研究的后基因組時(shí)代。無(wú)論是開發(fā)診斷試劑,還是研制疫苗,都需要對(duì)結(jié)核分枝桿菌的蛋白作用機(jī)理進(jìn)行基礎(chǔ)性和探索性的研究,本文就牛分枝桿菌蛋白基因相互作用研究工具及進(jìn)展加以綜述。

    1 酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白相互作用的有效分子技術(shù)

    酵母雙雜交技術(shù)完全模擬了體內(nèi)環(huán)境下蛋白間的相互作用,具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。酵母菌株AH109帶有報(bào)告基因,正常的AH109菌株在缺少任何一種營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中都不能生長(zhǎng)。將已知蛋白基因克隆至誘餌質(zhì)粒(Bait Plasmid,pGBK-T7),將靶蛋白基因克隆至獵物質(zhì)粒(Prey Plasmid,pACT-2),只有當(dāng)質(zhì)粒pGBK-T7和pACT-2 共同轉(zhuǎn)化入AH109,而且兩個(gè)質(zhì)粒表達(dá)的蛋白能夠相互結(jié)合時(shí),才能啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá),完成酵母雙雜交試驗(yàn),從而驗(yàn)證2個(gè)蛋白的相互作用。李巖等構(gòu)建了載體質(zhì)粒pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10,采用醋酸鋰法順序轉(zhuǎn)染酵母菌AH109,結(jié)果實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,證實(shí)了這2個(gè)基因的相互作用[4]。

    圖1  酵母雙雜交原理示意圖

    2 結(jié)核分枝桿菌重組菌株廣泛應(yīng)用于蛋白功能的研究

    Parish等建立了一種構(gòu)建分枝桿菌基因突變株的方法[5-6],并利用該方法構(gòu)建了plcABC、tlyA等基因敲除菌株。該方法主要包括兩個(gè)系列的質(zhì)粒載體:其中一個(gè)為pNIL質(zhì)粒,包含允許操縱靶基因序列的各種限制性酶切位點(diǎn);另一個(gè)系列為pGOAL質(zhì)粒,包含夾有標(biāo)記盒的PacI酶切位點(diǎn)。然后通過(guò)從pGOAL載體中克隆標(biāo)記盒,插入至已經(jīng)帶有要突變基因的pNIL載體中,構(gòu)建自殺質(zhì)粒和基因突變結(jié)核分枝桿菌菌株。

    Julia等建立了pJV53體系構(gòu)建基因突變菌株,該方法更為高效和簡(jiǎn)便[7-8]。其基本步驟如下(見圖2,引自Julia )。

    2.1基因敲除雙鏈DNA的擴(kuò)增

    從Gene bank上查詢已知蛋白或靶蛋白(簡(jiǎn)稱為目標(biāo)蛋白)的序列及其兩側(cè)的序列,按照其兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)引物,至少保留有500bp的兩側(cè)同源序列,擴(kuò)增出僅有兩側(cè)序列而刪除目標(biāo)蛋白基因的PCR片段,即基因敲除雙鏈DNA。將基因敲除雙鏈DNA克隆至pYUB125或pYUB854質(zhì)粒中,利用PCR擴(kuò)增或酶切技術(shù),制備基因敲除雙鏈DNA。

    圖2  基因敲除菌株構(gòu)建的基本步驟

    將DNA片段擴(kuò)增至pYUB854。采用在基因敲除重組菌株中增加潮霉素抗性基因的策略,分2段分別將目標(biāo)蛋白基因兩側(cè)的同源序列擴(kuò)增到pYUB854質(zhì)粒中潮霉素抗性基因的兩端。

    2.2制備牛結(jié)核分枝桿菌/pJV53感受態(tài)細(xì)胞

    首先培養(yǎng)牛分枝桿菌,當(dāng)液體培養(yǎng)的牛結(jié)核分枝桿菌OD600 = 0.8時(shí)收獲,使用甘油法制備感受態(tài)細(xì)胞。其次培養(yǎng)提純pJV53,將pJV53用電轉(zhuǎn)法感染至牛結(jié)核分枝桿菌中,制備牛結(jié)核分枝桿菌/ pJV53感受態(tài)細(xì)胞。最后將該感受態(tài)細(xì)胞再次培養(yǎng),當(dāng)OD600 = 0.5,加入乙酰胺,培養(yǎng)一段時(shí)間后,如前述再次制備牛結(jié)核分枝桿菌/pJV53感受態(tài)細(xì)胞,并可用紫外線照射處理感受態(tài)細(xì)胞。

    使用pJV53體系構(gòu)建基因敲除分枝桿菌菌株的基本原理是pJV53質(zhì)粒中的Che9c gp60和gp61蛋白可以作為DNA外切酶在菌體內(nèi)發(fā)揮作用,從而實(shí)現(xiàn)基因敲除DNA片段與菌株基因組在菌株體內(nèi)的雜交,完成基因組的突變(見圖3,引自Julia)。

    2.3將基因敲除雙鏈DNA片段轉(zhuǎn)化至牛結(jié)核分枝桿菌中

    圖3 基因突變分枝桿菌菌株構(gòu)建示意圖

    將分枝桿菌/pJV53感受態(tài)、基因敲除雙鏈DNA片段、pJV53 DNA按比例混合,至冰上作用10分鐘,使用電轉(zhuǎn)化儀轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于7H9 液體中培養(yǎng)2小時(shí),然后接種于固體培養(yǎng)基,使其長(zhǎng)出陽(yáng)性克隆菌落。

    當(dāng)使用潮霉素抗性策略時(shí),應(yīng)使用潮霉素抗性選擇培養(yǎng)基。

    2.4篩選、鑒定陽(yáng)性菌落

    挑選單個(gè)菌落,擴(kuò)大培養(yǎng),然后使用PCR方法鑒定陽(yáng)性菌落,經(jīng)測(cè)序確定目標(biāo)蛋白基因已經(jīng)敲除,將陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng),保存?zhèn)溆?。?dāng)使用潮霉素抗性策略時(shí),應(yīng)使用潮霉素抗性選擇培養(yǎng)基。陽(yáng)性菌落鑒定完成后,可使用圖3“中”的策略去掉潮霉素抗性基因。

    3 GST pull-down試驗(yàn)檢測(cè)已知蛋白和靶蛋白的相互作用

    Bryant等通過(guò)GST Pull down試驗(yàn)研究分枝桿菌蛋白EspBM和Mh3879c的相互作用[9]。該方法主要分為2個(gè)步驟。

    3.1構(gòu)建質(zhì)粒與親和純化

    構(gòu)建已知蛋白pGST重組質(zhì)粒,融合表達(dá)pGST已知蛋白,將表達(dá)的已知融合蛋白經(jīng)過(guò)親和層析純化,將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物。

    3.2GST pull-down試驗(yàn)操作

    培養(yǎng)分枝桿菌,制備全菌裂解物和細(xì)菌培養(yǎng)濾液蛋白混合物作為目的蛋白溶液,將目的蛋白溶液過(guò)柱,從中捕獲與之相互作用的靶蛋白。洗脫層析結(jié)合物后,使用western-blot檢測(cè)靶蛋白的表達(dá)水平,從而研究已知蛋白和靶蛋白的相互作用。

    4 分枝桿菌蛋白基因相互作用研究進(jìn)展

    目前研究較多的有RD1 區(qū)基因[9-11]。這是一組與結(jié)核桿菌致病性相關(guān)的基因,其中ESAT-6能廣泛地被人和不同種屬動(dòng)物的免疫系統(tǒng)所識(shí)別,誘導(dǎo)宿主的特異性CD4+T 細(xì)胞和CD8+CTL的增殖及IFN的大量產(chǎn)生。CFP-10也是一種免疫優(yōu)勢(shì)抗原,能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫。二者在保護(hù)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用,是構(gòu)建新型結(jié)核疫苗和診斷試劑的候選基因。ESAT-6 和CFP-10 編碼基因的位置相鄰,處于同一操縱子中協(xié)同轉(zhuǎn)錄。Priscille等通過(guò)敲除目的基因[12],證實(shí)Rv3868、 Rv3869、Rv3870、Rv3871和Rv3877等基因?qū)τ贓SAT-6和CFP10的分泌是必需的,而Rv3873 和Rv3876的失活并不影響ESAT-6的分泌。Bryant等證實(shí)EspBM和Mh3879c具有相互作用,同時(shí)其結(jié)核分枝桿菌同源物EspBT與Rv3879c也具有相互作用,而敲除了EspBM與Mh3879c結(jié)合位點(diǎn)的突變株就不能分泌EspBM[9]。

    Janka等使用酵母雙雜交試驗(yàn)[11],發(fā)現(xiàn)ESAT-6和CFP10能夠形成異源和同源二聚體,Rv3873、Rv3866、Rv3868和CFP-10可以相互作用形成異源二聚體,但這些蛋白與ESAT-6并無(wú)相互作用,揭示ESAT-6必須通過(guò)與CFP-10的相互作用才能夠發(fā)揮其作用。這些蛋白相互作用形成一個(gè)外分泌通道,但在該外分泌通道中,仍然缺乏ESAT-5通過(guò)細(xì)胞壁的關(guān)鍵蛋白環(huán)節(jié)

    Sa?d-Salim等發(fā)現(xiàn)MPB70和MPB83這2種蛋白的高水平表達(dá)與Rv0444c的突變相關(guān)聯(lián)[13]。高水平表達(dá)MPB70/MPB83的卡介苗俄羅斯菌株,經(jīng)補(bǔ)充野生型Rv0444c基因后,會(huì)導(dǎo)致mpb70/ mpb83的表達(dá)顯著下降。通過(guò)酵母雙雜交,證實(shí)Rv0444c編碼蛋白的N端與SigK相互作用,進(jìn)一步證明了Rv0444c編碼抗SigK蛋白,該基因的變異則可以解釋部分菌株MPT70/MPT83的高水平表達(dá)。但目前對(duì)這些具有強(qiáng)烈免疫反應(yīng)分子的作用機(jī)理仍然缺乏深入的研究。

    Blair等發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的Lsr2可導(dǎo)致ESX分泌系統(tǒng)及PE/PPE蛋白家族表達(dá)的下調(diào)[14]。2012年,Khalid等研究了PPE18調(diào)節(jié)作用[15]。Valentina等深入研究了PE11-PPE17的配對(duì),通過(guò)構(gòu)建PE11敲除菌株和PPE區(qū)域突變菌株,發(fā)現(xiàn)PPE17不是分泌蛋白而是暴露于菌株表面;PPE17可以在缺乏PE11的情況下定位于菌株表面,而該分子的PPE區(qū)域是定位的關(guān)鍵區(qū)域[16]。相對(duì)而言,更多的PE/PPE蛋白的作用機(jī)理尚不清晰。

    5 牛分枝桿菌分子蛋白相互作用的研究意義

    國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者嘗試克隆表達(dá)不同的或聯(lián)合的分子抗原,用于牛結(jié)核病診斷試劑和疫苗的研發(fā),但其效果要差于牛結(jié)核全菌提取抗原制備的診斷試劑或全菌疫苗(BCG)。牛結(jié)核分枝桿菌與病毒不同,其單個(gè)蛋白的發(fā)揮效應(yīng)要受制于其上下游的多個(gè)蛋白。診斷試劑研發(fā)中,ESAT-6和CFP10往往要聯(lián)合才能高效發(fā)揮其作用;疫苗研發(fā)中,機(jī)體內(nèi)的某個(gè)或某幾個(gè)聯(lián)合分子重組疫苗,雖然能表達(dá),但其作用機(jī)理多不清晰。如何通過(guò)上下游調(diào)節(jié)信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)、如何通過(guò)細(xì)胞壁分泌到環(huán)境中進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)等均不清晰。只有闡明了這些蛋白的作用機(jī)理,才能夠進(jìn)一步研發(fā)高效的牛結(jié)核病診斷試劑抗原和重組疫苗。因此,牛分枝桿菌分子蛋白相互作用的研究,將為開發(fā)診斷試劑和疫苗提供工具和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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    (責(zé)任編輯:朱迪國(guó))

    M. bovis Protein Interaction and Its Investigative Tools

    Zhang Xiyue1,Shi Yang2,F(xiàn)an Weixing1
    (1.China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao,Shandong 266032;2.Huangdao Animal Husbandry and Veterinary Bureau,Qingdao,Shandong 266400)

    Several tools were applied in the M.bovis protein interaction investigation. First,the yeast two-hybrid was applied to verify two protein interactions in-vivo. Second,mutant strains were constructed to elucidate the mechanism of protein function. The strategies include:(1) amplifi cation of knockout DNA;(2)preparation of Mycobacterium/pJV53 competent cells;(3)transportation of knockout DNA to competent cells;(4)screening and identification of positive colonies. The third,GST pull-down was applied to investigate known protein and target protein interaction. RD1 was investigated intensively in M. bovis protein interactions. The mechanisms were found such as that dimmer was formed by ESAT-6 and CFP10,interaction was existed in Rv3873,Rv3866, Rv3868 and CFP-10,and ESAT-6 achieved its function only after it was combined with CFP-10. These fi ndings suggest that elucidation of the interactions could facilitate the development of effi cient diagnostic reagents and vaccines for bovine tuberculosis.

    M. bovis;protein;interaction

    S852.23

    B

    1005-944X(2015)09-0064-05

    科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)(2012FY111000);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(奶牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(CARS37)

    范偉興

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