外源褪黑素對離體培養(yǎng)虎杖生長的影響

張來軍+賈敬芬+王鳳琴等

摘要： 研究不同濃度外源褪黑素[N-acetyl-5-methoxytryptamine，即melatonin（MEL）]對離體培養(yǎng)虎杖莖生長、根分化的影響。在培養(yǎng)基中分別添加3、6、12、24 μmol/L MEL，觀察其對扦插的虎杖外植體生長的影響，并用相應(yīng)濃度的IAA（indole-3-acetic acid）作對照。結(jié)果表明，各種濃度的MEL對虎杖的生長都產(chǎn)生明顯影響，低濃度的MEL（3、6 μmol/L）有助于莖、根的生長，其中在6 μmol/L MEL作用下根長、根數(shù)、莖高、葉面積、生根率均達到最大或較大值；高濃度MEL（24 μmol/L）對虎杖生長有抑制作用。由結(jié)果可以看出，MEL可以調(diào)節(jié)離體培養(yǎng)虎杖的生長，其對虎杖生長的促進作用與IAA類似。

關(guān)鍵詞： 褪黑素；IAA；虎杖；組織培養(yǎng)；離體培養(yǎng)

中圖分類號：Q946.885+.9；S567.23+9.043 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0058-03

自1995年在植物體中發(fā)現(xiàn)褪黑素[N-acetyl-5-methoxytryptamine，即melatonin（MEL）] [1]后，植物體內(nèi)褪黑素的功能成為眾多學(xué)者研究的熱點，迄今為止研究已經(jīng)取得了很大進展，但是褪黑素在植物中作用的詳細機制還須要進一步研究。關(guān)于MEL的最初研究集中于對不同植物及植物的不同器官含量的測定 [2-3]，隨后一些報道揭示，MEL可能作為一種抗氧化劑存在于細菌、真菌、植物 [4-6]中。王英利等發(fā)現(xiàn)，外源MEL對增強UV-B輻射下生長的綠豆有防護作用 [7]。Lei等以胡蘿卜懸浮細胞為材料進行試驗表明，加入外源MEL降低了低溫脅迫下細胞的凋亡 [8]。Zhao等報道，MEL提高了低溫脅迫下大花紅景天（Rhodiola crenulata）愈傷組織的存活率 [9]。一些研究還發(fā)現(xiàn)，MEL對植物生長有促進作用 [10]。用外源MEL處理貫葉連翹，促進了根的形成 [11]；Arnao等用高濃度MEL短期處理羽扇豆（Lupinus albus L.）的下胚軸、子葉，發(fā)現(xiàn)MEL可以促進下胚軸形成不定根，子葉也顯著擴展 [12-13]。由于MEL結(jié)構(gòu)類似于IAA，是一種吲哚類化合物，利用離體培養(yǎng)體系研究外源MEL對植物生長的影響，是方便的研究體系，也為闡明植物體內(nèi)MEL的生理功能提供了更多的科學(xué)證據(jù)?；⒄龋≒olygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）為多年生蓼科草本植物，主要分布于秦嶺以南地區(qū)，以根或根莖入藥，其主要有效成分是芪類化合物、蒽醌類化合物，其中芪類化合物主要包括白藜蘆醇、白藜蘆醇苷。白藜蘆醇及其苷類是具有多種藥理作用的活性化合物，能夠抑制細胞和組織癌變、降血脂、抑菌、抗氧化、抗病毒、增強機體免疫力，還是一種安全的天然植物雌激素，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療及保健業(yè) [14]。將MEL應(yīng)用于虎杖的扦插培養(yǎng)，可以揭示MEL在植物組織培養(yǎng)過程中對生長可能起到的調(diào)節(jié)作用，也可為虎杖的組織培養(yǎng)提供新方法。本試驗將離體培養(yǎng)的虎杖分別置于附加不同濃度的MEL培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并用相應(yīng)濃度的IAA作對照，觀察MEL對離體培養(yǎng)的虎杖莖生長、根分化的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

虎杖外植體取自西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院果園，經(jīng)鑒定為虎杖（P. cuspidatum）。取當(dāng)年新生虎杖的帶葉莖段，流水沖洗6～10 h后用75%乙醇處理10～15 s，分別用無菌水沖洗1～2次、0.2%氯化汞溶液消毒5～7 min、無菌水沖洗3～4次，然后在無菌條件下剪掉葉片，剪成1 cm長莖段（留1個腋芽），接種于附加0.1 mg/L 6-BA、1 mg/L GA3、0.5 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（25±2） ℃，相對濕度60%～75%，人工光照12～14 h/d，光照度30 μmol/（m2·s）。以8周后再生出的無菌苗為試驗材料。

1.2 MEL、IAA處理

將虎杖無菌苗切成約1 cm長的莖段，保留1個腋芽，扦插在MS培養(yǎng)基（加B5培養(yǎng)基的有機成分）上。將MEL、IAA過濾滅菌，以不同的終濃度（0、3、6、12、24 μmol/L）加在培養(yǎng)基中，先在（25±2） ℃的暗環(huán)境下培養(yǎng)7 d，然后在（25±2） ℃、 相對濕度60%～75%、人工光照時間12～14 h/d、光照度 30 μmol/（m2·s） 的環(huán)境下培養(yǎng)。分別在4、6周后，測量根長、根誘導(dǎo)密度、莖的高度、葉片數(shù)量、葉面積。相關(guān)計算公式如下：

生根率=生根外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；

根誘導(dǎo)密度=生根數(shù)/出根外植體數(shù) [14]；

平均根長=根總長/根總數(shù)；

平均莖高=總莖高/存活外植體數(shù)；

葉面積=總面積/存活外植體數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

每個處理包括4個重復(fù)，每個重復(fù)由5個外植體組成。統(tǒng)計葉片數(shù)量、根的數(shù)量，測量根的長度、莖的高度。每株苗的每張葉葉面積用葉面積儀測量，單位cm2。統(tǒng)計形式為“均值±標準誤”，所取數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計分析，各組處理間進行單因素方差分析。試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

培養(yǎng)7～14 d后，扦插于培養(yǎng)基上的莖段開始出現(xiàn)腋芽，莖開始延長，隨后分化出根。培養(yǎng)6周后，將MEL對離體培養(yǎng)虎杖生長的調(diào)節(jié)作用與相同濃度下的IAA進行統(tǒng)計和對比。

由圖1可見，培養(yǎng)基中附加MEL、IAA提高了扦插的虎杖莖段的生根率；對照組（培養(yǎng)基中不加MEL、IAA）的生根率為41.7%，添加IAA的所有濃度梯度下的外植體生根率均大于對照組，MEL僅在濃度為24 μmol/L時的生根率與對照組相近，為40%，其余濃度梯度下的外植體生根率均大于對照組；IAA、MEL濃度為3 μmol/L時生根率達到最大值，分別為1000%、63.7%。

由圖2、圖3可見，苗的高度、葉面積均與附加的MEL、IAA及其濃度有一定相關(guān)性。附加低濃度MEL、IAA的培養(yǎng)基上，平均莖高、葉面積均高于對照組，MEL濃度為6 μmol/L或IAA濃度為3 μmol/L最有利于虎杖的生長，平均莖高、葉面積都達到最大值。其中MEL濃度為6 μmol/L的平均莖高為（7.63±1.45）cm，平均葉面積達到（29.7±10.1）cm2；IAA濃度為 3 μmol/L 的培養(yǎng)基上虎杖莖高為（7.09±1.69）cm，平均葉面積為（31.8±6.55）cm2；對照組的莖高、葉面積分別為（4.07±2.19）cm、（18.99±6.88）cm2；2個處理的葉面積、莖高均顯著大于對照組（P<0.05）。但是當(dāng)MEL、IAA的濃度升高時，虎杖生長受到抑制，MEL、IAA濃度為24 μmol/L時表現(xiàn)出的抑制效應(yīng)較強，24 μmol/L IAA的培養(yǎng)基上的莖高甚至低于對照組。相同濃度的MEL與IAA相比，MEL所誘導(dǎo)的葉面積雖然基本低于IAA誘導(dǎo)的葉面積，但是彼此間的差異并沒有達到顯著水平。

MEL、IAA都能誘導(dǎo)出豐富的根，根長、根誘導(dǎo)密度與濃度具有密切關(guān)系，根的生長情況見圖4、圖5。可以看出，低濃度的MEL、IAA促進根的生長，隨著濃度的進一步升高，根誘導(dǎo)密度、根長會減少。MEL的濃度為6 μmol/L時，虎杖的根誘導(dǎo)密度、根長達到最大或較大值，外植體根誘導(dǎo)密度為（2.44 ± 1.42）條/個，[CM（16]根長為（2.79 ± 1.20）cm；IAA濃度為 3 μmol/L時，根誘導(dǎo)密度、根長達到較大值，分別為（663±3.46）條/個、（0.95±0.27）cm；對照組的根誘導(dǎo)密度為（1.67±1.53）條/個，根長為（2.66±1.58）cm。此外，MEL、IAA所誘導(dǎo)的根的形態(tài)有很大差異，詳見圖6-A3、圖 6-B3、圖 6-C3。附加IAA的培養(yǎng)基上，莖段基部膨大，形成類似愈傷組織的結(jié)構(gòu)，根數(shù)多且短，根上密被根毛；附加MEL的培養(yǎng)基上，莖段基部沒有膨大，根數(shù)少而長，主根、側(cè)根形態(tài)明顯，根的形態(tài)與對照組所形成的根極為相似，因此在濃度相同的情況下，MEL誘導(dǎo)所產(chǎn)生的根的長度極顯著大于IAA處理組（P<001）（圖5）；除24 μmol/L處理外，根誘導(dǎo)密度，即平均生根數(shù)極顯著低于IAA組（P<0.01）（圖4）。

6 μmol/L MEL、IAA對扦插的虎杖莖段生根、芽分化的影響見圖6。在附加MEL的培養(yǎng)基上，根分化的時間明顯早于對照組、IAA處理組，很多莖段基部在接種1周后開始生根，而附加IAA的培養(yǎng)基上接種2周后才陸續(xù)分化出根。

3 討論

植物組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基附加植物生長調(diào)節(jié)物及其濃度顯著影響苗的生長、發(fā)育，離體培養(yǎng)虎杖時，與對照組相比，附加

MEL、IAA的培養(yǎng)基上芽生長健壯，葉片數(shù)、根數(shù)多，或具有更長的根。在本試驗中，MEL與IAA的作用類似，均促進了虎杖莖、根的生長，且低濃度的促進效果更為明顯。這一現(xiàn)象與用外源MEL誘導(dǎo)羽扇豆下胚軸產(chǎn)生不定根 [12]以及Murch等用MEL促進貫葉連翹根的形成得到的結(jié)果 [11]相似；Chen等試驗發(fā)現(xiàn)，較低濃度的外源MEL提高了芥菜（Brassica juncea）內(nèi)源IAA的含量，從而推測低濃度的MEL促進根生長的原因是外源MEL激發(fā)內(nèi)源IAA的合成 [15]，而高濃度時對植物生長表現(xiàn)的抑制效果可能是由IAA誘導(dǎo)乙烯合成造成的 [10]。

植物離體再生過程中，外源激素的吸收和代謝影響內(nèi)源

[FL（2K2]激素的活動，從而影響離體培養(yǎng)物的生長。不同生長素有不同的代謝途徑，調(diào)節(jié)細胞生長和分化的方式與效果存在很大差異，MEL、IAA都為吲哚類化合物，對植物都有生長調(diào)節(jié)作用，但表現(xiàn)不盡相同。這些試驗結(jié)果為進一步了解MEL在植物中的功能提供了試驗依據(jù)。

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