內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激在納米氧化鈰所致肺損傷中的作用

楊 靜，吳 剛，李園園，呂麗萍，劉 揚(yáng)，龐一強(qiáng)

（1.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014040；2.鄂爾多斯市衛(wèi)生學(xué)校，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000；3.包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014040；4.包頭市第四醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古包頭014030）

納米氧化鈰（CeO2）具有優(yōu)異的拋光、催化、紫外吸收和離子導(dǎo)電等特性，因而廣泛地應(yīng)用于微電路拋光、空氣凈化以及固體氧化物燃料電池等眾多領(lǐng)域［1］。隨著納米CeO2廣泛的應(yīng)用，其暴露人群和暴露量必將日趨增加。有研究顯示納米氧化鈰暴露可導(dǎo)致肺組織炎癥反應(yīng)，氣血屏障損傷，長(zhǎng)期暴露最終導(dǎo)致肺纖維化，但具體機(jī)制尚不明確。有研究表明氧化應(yīng)激參與了肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展［2］；而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在多種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用［3］。本研究擬用不同劑量納米氧化鈰進(jìn)行氣管滴注染毒，觀察各組大鼠肺組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白GRP78和氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD及MDA的變化，對(duì)納米氧化鈰所致肺損傷的可能機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠27只，體重220g～300g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器及試劑 納米CeO2（35nm±3nm），杭州萬(wàn)景新材料有限公司產(chǎn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.9%）。兔抗大鼠GRP78單克隆抗體，北京博奧森公司產(chǎn)品；山羊抗兔IgG、免疫組織化學(xué)SP試劑盒、DAB顯色劑，福州邁新產(chǎn)品；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及取材 購(gòu)進(jìn)大鼠后先進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，普飼，自由飲水。1周后，27只大鼠隨機(jī)分為高劑量組（400mg／kg）、低劑量組（100mg／kg）和對(duì)照組，每組9只。染毒組大鼠以30g／L戊巴比妥鈉麻醉后，采用非暴露式氣管滴注染毒（納米氧化鈰顆粒用生理鹽水配成懸浮液后高溫消毒并進(jìn)行超聲分散），滴注量為2mL／kg，對(duì)照組注入等體積的生理鹽水。染毒第28天時(shí)，30g／L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，促凝管腹主動(dòng)脈取血，并取部分肺葉并用100g／L中性甲醛固定，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 血清SOD活力，MDA含量檢測(cè) 促凝管收集的血液常溫下放置3h后以3 000r／min轉(zhuǎn)速離心10min后取上層血清，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測(cè)定SOD活力，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA［4］，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。

1.2.3 病理學(xué)觀察 經(jīng)100g／L甲醛溶液固定超過(guò)48h的肺組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)改變，包埋好的蠟塊同時(shí)用于后期免疫組化。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)肺組織GRP78蛋白表達(dá)按照文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行免疫組化操作組織切片，常規(guī)脫蠟、水化，加入枸櫞酸鹽緩沖液于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，30mL／L雙氧水封閉，滴加1∶200稀釋的GRP78一抗4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育15min，PBS沖洗3次，DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染，10mL／L鹽酸-酒精中分化數(shù)秒，氨水反藍(lán)數(shù)秒，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

1.2.5 結(jié)果分析 由病理科醫(yī)師協(xié)助進(jìn)行結(jié)果判斷：以北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以0.01mol／L PBS液替代一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃（褐）色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，GRP78的陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)以染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×染色細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)表示。染色強(qiáng)度按顏色評(píng)分：完全陰性記0分，黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；染色細(xì)胞比例按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：＜5%、5%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%分別評(píng)為0、1、2、3、4分。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±SD表示，多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，若方差齊，各組之間均數(shù)的比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，采用Games-Howell檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清SOD活性和MDA含量

結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，不同濃度納米CeO2顆粒染毒后大鼠血清SOD活力與MDA含量均降低。

2.2 肺組織病理學(xué)變化

肉眼觀察：對(duì)照組大鼠肺組織顏色為粉紅色，觸之較為柔軟，彈性高；染毒組大鼠肺組織顏色較暗，呈灰白色，彈性較差，部分肺組織表面可見(jiàn)白色結(jié)節(jié)，觸之硬，剖檢時(shí)有明顯的顆粒感，肺組織表面有明顯的結(jié)節(jié)。

光學(xué)顯微鏡觀察：對(duì)照組大鼠肺組織固有結(jié)構(gòu)完整，無(wú)破壞，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生；肺泡隔光滑，未見(jiàn)增寬（圖1A）。染毒組：大量CeO2顆粒沉積，且面積較大，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁嚴(yán)重充血，大部分肺組織纖維化，形成肺實(shí)變，并有異物肉芽腫形成，如圖中箭頭所示（圖1B）。

表1 不同濃度納米CeO2顆粒染毒后大鼠血清SOD活力和MDA含量Table 1 The seral levels of SOD and MDA in rats treated with different concentrations of nano CeO2

2.3 肺組織GRP78表達(dá)情況

GRP78蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，鏡下染色呈棕黃（褐）色，如圖2箭頭所示。3組肺組織GRP78蛋白的陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)分別為：對(duì)照組1.40±0.84，400mg／kg染毒組6.90±1.45，100mg／kg染毒組4.00±1.15。不同劑量染毒組與對(duì)照組比較，差異顯著（P＜0.05）。

圖1 不同濃度納米CeO2顆粒作用肺組織病理變化（HE，400×）Fig.1 Pulmonary histopathologyical lesions in rats treated with different concentrations of nano CeO2（HE，400×）

圖2 免疫組化法檢測(cè)不同濃度納米CeO2顆粒作用肺組織GRP78表達(dá)（SP，400×）Fig.2 Expression of GRP78in lung of rats treated with different concentrations of nano CeO2detected by immunohistochemistry（SP，400×）

3 討論

氧化應(yīng)激［6］是指機(jī)體內(nèi)高活性物質(zhì)如ROS（reactive oxygen species）產(chǎn)生過(guò)多，超出了機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致氧化／抗氧化失衡的一種狀態(tài)。ROS又稱(chēng)反應(yīng)性氧類(lèi)物質(zhì)，包括超氧陰離子（·O2-）、羥自由基（-OH·）和過(guò)氧化氫（H2O2）等，可以由細(xì)胞（如吞噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）的正常代謝產(chǎn)生；也可以由外源因素誘導(dǎo)產(chǎn)生（如吸煙、輻射、粉塵等）。有研究表明［7-10］，很多納米材料如納米氧化鋅、納米二氧化鈦、納米二氧化硅、納米氧化鋁等可以通過(guò)氧化應(yīng)激作用導(dǎo)致DNA受損，細(xì)胞死亡和組織損傷。而本研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鈰經(jīng)肺染毒大鼠后血清MDA和SOD無(wú)明顯改變，說(shuō)明從血清學(xué)指標(biāo)觀察其所致的肺損傷可能與氧化應(yīng)激的關(guān)系不大，還需進(jìn)一步研究。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中十分重要的細(xì)胞器，具有折疊、翻譯蛋白及維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等生理作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可由包括缺血（氧）、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、葡萄糖等）缺乏及Ca2＋-ATP 酶抑制劑等多種因素誘導(dǎo)發(fā)生［11］。而GRP78作為ERS早期活化的標(biāo)志性基因備受關(guān)注［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用非暴露式氣管滴注染毒法將35nm±3nm納米氧化鈰以不同劑量作用大鼠肺組織，不僅引起大鼠肺損傷，還使GRP78的表達(dá)水平增高，說(shuō)明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了納米氧化鈰顆粒所致肺損傷。導(dǎo)致發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的原因可能是由于納米氧化鈰顆粒引起的物理?yè)p傷引起的［14］，納米氧化鈰顆粒作為不可生物降解的微粒屬于非法外源物進(jìn)入生物體，不能被合法轉(zhuǎn)運(yùn)或參與代謝。因此，它在體內(nèi)作為物理粒子與機(jī)體發(fā)生相互作用，大量的納米氧化鈰顆粒聚集堵塞微循環(huán)、導(dǎo)致肺組織缺血缺氧，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，或者破壞性穿越細(xì)胞膜及嵌入生物大分子空穴等引起生物結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)而引發(fā)肺組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而產(chǎn)生進(jìn)一步損傷和功能異常。

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