牛副流感病毒3型N基因的克隆與系統(tǒng)進(jìn)化分析

薛 娟，曹 思，張 峣，冉旭華，聞曉波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶 163319）

牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3）屬于副黏病毒科副黏病毒屬成員，為單股負(fù)鏈有囊膜的RNA病毒［1］，我國(guó)于2010年成功分離得到該病毒。BPIV-3在臨床上是牛呼吸道疾病綜合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）的主要病原［2］，而牛呼吸道疾病綜合征是引起世界范圍內(nèi)的舍飼牛發(fā)病和死亡的主要原因［3］，多國(guó)均有該病發(fā)生的報(bào)道［4］。牛副流感病毒3型屬于呼吸道病毒［5］，同屬的成員還有人副流感病毒3型、人副流感病毒1型和仙臺(tái)病毒。BPIV-3是一類重要的人畜共患病毒，與人副流感病毒3型的結(jié)構(gòu)蛋白HN、F、N、P、C和M蛋白的氨基酸序列高度相似［6］。其中N蛋白相似度高達(dá)86%，這預(yù)示著該基因保守性可能較高。

本試驗(yàn)針對(duì)BPIV-3-N基因進(jìn)行研究。根據(jù)GenBank上已知參考序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，采用RT-PCR方法擴(kuò)增從大慶地區(qū)某牛場(chǎng)患有呼吸道疾病的病牛體內(nèi)分離得到的BPIV-3N基因，并用分子生物學(xué)軟件對(duì)其核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，為研究該病毒的地理分布及分子流行病學(xué)特點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 BPIV-3從黑龍江大慶地區(qū)某牛場(chǎng)患有呼吸道疾病的病牛鼻液中分離得到，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 酶和試劑 pfu DNA Polymerase，MMuLV Reverse Transcriptase，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System A9280試劑盒、DNA Marker DL 2 000、6×Loading buffer、dNTP（2.5mmol／L）、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、pMD?18-T Vector，TaKaRa公司產(chǎn)品；Trizol，Invitrogen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒，Tiangen公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank上收錄的BPIV-3基因全序列（GenBank：AB770484.1），設(shè)計(jì)特異性引物，委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。BPIV-3-N-Up：GCCGAAAGGTGAGGGGAAAGAAATC；BPIV-3-N-Low：ACTTGTTGCTGATGATGGTGATC。

1.2.2 RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增 取病毒液，參照TRIzol使用說明書進(jìn)行RNA提取，取樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系如下：RNA 3μL，引物1μL，混勻，70℃5min，冰浴2min；加入5×Reaction buffer 4μL，RiboLockTMRibounuclease inhibitor 0.5μL，dNTP（2.5mmol／L）8μL，混勻，37℃5min，冰浴2min；加入 M-MuLV Reverse trabscriptase 2μL，混勻，37℃2h，70℃10min終止反應(yīng)。獲得cDNA后立即進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系如下：10 × pfu buffer with MgSO42 μL，dNTP 2.5mmol／L 1.6μL，BPIV-3-N-Up和 BPIV-3-NLow各0.2μL，cDNA 1μL，pfu DNA polymerase 0.4μL，加入滅菌純水將體積補(bǔ)至20μL。擴(kuò)增程序如下：95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃2min 48s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序 采用 Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化后產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布在含氨芐青霉素（終濃度為100μg／mL）的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，堿裂解法小量提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定后，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMD18-T-BPIV-3-N，并送往北京六合華大基因測(cè)序。

1.2.4 序列分析 通過 NCBI Blast分析，選取同源性較高的序列作為參考序列，進(jìn)行分析，參考毒株見表1。應(yīng)用DNA Star Megalign，DNA Man等軟件進(jìn)行核苷酸序列與氨基酸同源性比較分析。

表1 BPIV-3-N序列分析參考毒株Table 1 Reference strains of BPIV-3-N sequence analysis

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

以牛副流感病毒3型的cDNA為模板，BPIV-3-N-UP、BPIV-3-N-LOW 為引物擴(kuò)增出一條1 548bp的片段，與預(yù)期大小相符（圖1）。

圖1 BPIV-3-N的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products of BPIV-3-N

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)入到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個(gè)菌落，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后（圖2），陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMD18-T-BPIV-3-N。將陽(yáng)性樣品送往北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-T-BPIV3-N雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the double enzyme digestion products of recombinant plasmids pMD18-T-BPIV3-N

2.3 測(cè)序結(jié)果及序列比較分析

測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增獲得的BPIV-3-N基因全長(zhǎng)1 548bp，編碼515個(gè)氨基酸，推測(cè)其分子質(zhì)量為52.7ku。利用DNA Star軟件對(duì)BPIV-3-N核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見圖3，表明該序列與日本分離的910N株的N基因同源性較高（氨基酸同源性為100%，核苷酸同源性為99.7%），此外，該序列與來(lái)自日本的疫苗株BN-CE與BN-1也有同樣高的同源性（氨基酸同源性為100%，核苷酸同源性為99.7%）。另外，該序列與中國(guó)的分離株SD0835同源性較低（氨基酸同源性僅有60.9%，核苷酸同源性也只達(dá)到82.5%）。

圖3 同源性分析Fig.3 Analysis of homology

3 討論

據(jù)美國(guó)學(xué)者Snowder G D等［7］研究發(fā)現(xiàn)BPIV-3是引起B(yǎng)RDC的主要病原之一，BRDC已經(jīng)成為威脅大規(guī)模飼舍養(yǎng)牛的重要疾病之一［8］。但截止目前，人們對(duì)于BPIV-3的研究還處于初級(jí)階段，目前我國(guó)尚無(wú)商品化疫苗可供使用，對(duì)于其致病機(jī)理尚未明確，而流行病學(xué)特點(diǎn)的研究也并不完善。

BPIV-3基因組全長(zhǎng)15 456bp，編碼了包括核衣殼蛋白（N）在內(nèi)的8種結(jié)構(gòu)蛋白。BPIV至少含有6種蛋白，即N、P、F、M、HN、L等蛋白，具有血凝素與神經(jīng)氨酸酶活性。N基因編碼核衣殼蛋白，約編碼515個(gè)氨基酸。N蛋白是核衣殼的主要成分，與病毒的RNA直接結(jié)合，高度保守，在病毒感染時(shí)可以引起強(qiáng)烈的抗原反應(yīng)［9］。

核衣殼蛋白是BPIV-3的重要結(jié)構(gòu)蛋白，在8種結(jié)構(gòu)蛋白中該蛋白的保守性最高，所以通常也將其的作為BPIV-3的鑒定基因。N蛋白單體呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，大量的N蛋白單體相互結(jié)合構(gòu)成了一個(gè)中空的管道狀結(jié)構(gòu)，即病毒的核衣殼。該結(jié)構(gòu)可以保護(hù)病毒的RNA不被核酶降解。核衣殼的C端結(jié)構(gòu)域上含有種屬抗原決定簇和對(duì)蛋白酶敏感的磷酸化位點(diǎn)，因此N蛋白具有很好的免疫原性，能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答［10］。本試驗(yàn)所獲得的N基因序列分析表明，該分離株C端結(jié)構(gòu)完整與參考序列無(wú)明顯差異，氨基酸分析表明該毒株與日本分離株同源性較高，與中國(guó)分離株同源性較低。本研究為進(jìn)一步研究BPIV-3流行病學(xué)特點(diǎn)提供了參考。

［1］Schmidt A C，McAuliffe J M，Huang A，et al.Bovine parainfluenza virus type 3（BPIV3）fusion and hemagglutinin-neuraminidase glycoproteins make an important contribution to the re-stricted replication of BPIV3in primates［J］.J Virol，2000，74（19）：8922-8929.

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