腺相關(guān)病毒衣殼蛋白修飾的研究進(jìn)展

陳倩影，馬萃嬌，呂亞豐，曹春雨

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443002

基因治療是以治療或治愈某種疾病為目的，引入、去除或改變遺傳密碼內(nèi)容，基于遞送編碼治療性蛋白質(zhì)或RNA作為基因編輯策略，在基因水平上治療疾病的方法[1]。選擇高效、安全的遞送載體是實(shí)現(xiàn)基因治療的首要問題。目前，基因治療主要采用的遞送載體系統(tǒng)有病毒載體[腺病毒載體、慢病毒載體[2]、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)載體]、納米顆粒和脂質(zhì)體等。其中AAV載體具有基因容量較大、基因組不整合、無致病性等顯著優(yōu)勢(shì)，近年來已成為基因治療研究的主要遞送載體[3-4]。2012年以來，美國(guó)食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)基于多種AAV載體開發(fā)的基因治療藥物，如Glybera、Luxturna?和Zolgensma?分別用于遺傳性脂蛋白脂肪酶缺乏癥、Leber先天性黑蒙病和脊髓性肌萎縮癥的臨床治療[5]。鑒于衣殼蛋白靶向性修飾在AAV載體研究中的核心作用，本文就AAV及其衣殼蛋白靶向性修飾的新近研究進(jìn)展做一綜述，并討論AAV衣殼改造在基因治療中的前景及應(yīng)用。

1 AAV生物學(xué)特性

1.1 AAV 結(jié)構(gòu) AAV 屬于細(xì)小病毒科，是單鏈DNA病毒，基因組包含兩端的反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeats，ITRs)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子(P5、P19、P40)和兩個(gè)分別編碼Rep和Cap蛋白的開放閱讀框，全長(zhǎng)4.7 kb(圖1)。ITRs是AAV基因組中必需的順式作用元件，其由180個(gè)堿基組成，是DNA復(fù)制、包裝和整合位點(diǎn)的起始位點(diǎn)并在單鏈DNA復(fù)制過程中起“引物”的作用[6]。Rep基因編碼病毒DNA復(fù)制和組裝需四種蛋白質(zhì)——Rep40、Rep52、Rep68和Rep78。Cap基因編碼來自兩個(gè)交替剪接mRNA的三個(gè)病毒衣殼蛋白——VP1、VP2和VP3，同時(shí)編碼組裝激活蛋白[7]。AAV衣殼VP1、VP2和VP3蛋白分子組裝成直徑約25 nm的二十面體粒子，其VP1、VP2和VP3蛋白分子的比例為1∶1∶10。

圖1 AAV的基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of AAV genome structure

1.2 AAV 血清型及其細(xì)胞受體 AAV 病毒基因組中，ITR和Rep基因序列相對(duì)保守，而Cap基因序列則差異性較大，由此產(chǎn)生具有不同衣殼蛋白的AAV病毒。由于AAV病毒衣殼蛋白的氨基酸組成直接決定其組織親嗜性和感染細(xì)胞的能力，研究者以此為標(biāo)準(zhǔn)把近年來鑒定的來自人類或非人靈長(zhǎng)類的AAV病毒分為13個(gè)血清型，即 AAV1 ~ AAV13[8]。具有代表性的是 AAV1 ~AAV9，比對(duì) AAV1 ~ AAV9 的衣殼蛋白序列發(fā)現(xiàn)，這9個(gè)AAV血清型的衣殼蛋白氨基酸序列一致性為58% ~ 99%，其中AAV1與AAV9衣殼蛋白氨基酸序列一致性達(dá)99%、與AAV2/3/6/7/8衣殼蛋白氨基酸序列一致性達(dá)82%以上[9]。這表明AAV衣殼氨基酸組成及結(jié)構(gòu)是決定其組織親嗜性的關(guān)鍵，而現(xiàn)有研究已證明細(xì)胞表面多糖與AAV衣殼蛋白的結(jié)合是影響AAV感染細(xì)胞能力的重要因素。AAV成員轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的能力已被證明是由于其衣殼與不同細(xì)胞表面聚糖結(jié)合。細(xì)胞膜表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)是第一個(gè)被鑒定的AAV病毒細(xì)胞受體，其通過識(shí)別結(jié)合AAV2/3/6血清型衣殼突出部蛋白堿性區(qū)域(包含第585位和第588位精氨酸)，使病毒附著于細(xì)胞表面，由此啟動(dòng)AAV進(jìn)入細(xì)胞的過程(圖2)[10]。此后，唾液酸和N末端半乳糖基化多糖也被證明是AAV病毒進(jìn)入細(xì)胞的表面多糖受體[11-12]。目前，AAV病毒的細(xì)胞表面受體主要是三大類多糖，即HSPG受體(AAV2、AAV3和AAV6)、唾液酸受體(AAV1、AAV4、AAV5和AAV6)和半乳糖基化受體(AAV9)[13]。除多糖受體以外，2016年P(guān)illay等[14]報(bào)道了一種介導(dǎo)AAV細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)受體AAVR(又稱為KIAA0319L)。AAVR是Ⅰ型跨膜蛋白，通過胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域(多囊腎病結(jié)構(gòu)域)直接與鄰近二十面體三重軸的AAV2衣殼刺突蛋白相互作用，由此介導(dǎo)AAV2的入胞作用。

圖2 AAV血清型受體分類Fig.2 Classification of AAV serotype receptors

1.3 AAV 的組織嗜性和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 不同AAV血清型對(duì)人體組織的嗜性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著不同，盡管多數(shù)AAV都能在肝中富集，但AAV8具有脂肪組織嗜性[15]、AAV9具有心臟、肝、骨骼肌組織嗜性并能夠穿越血-腦脊液屏障富集于腦組織[16]。一方面，AAV的組織嗜性和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率主要依賴于衣殼蛋白結(jié)構(gòu)，尤其是VP3與宿主細(xì)胞表面受體的相互作用；另一方面，當(dāng)AAV進(jìn)入宿主細(xì)胞后，AAV遞送基因在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)依賴于AAV從細(xì)胞內(nèi)體中釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，而這一過程與宿主細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)分子和衣殼蛋白VP1的相互作用有關(guān)[17]。

2 AAV衣殼靶向性修飾

如何通過改造AAV衣殼蛋白獲得具有組織或細(xì)胞靶向性的高效基因遞送載體是基因治療研究領(lǐng)域的核心問題。近年來，基于合理設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化和化學(xué)方法修飾等基因工程策略的AAV衣殼修飾已廣泛用于AAV基因靶向遞送研究。

2.1 合理設(shè)計(jì) 合理設(shè)計(jì)，即通過基因工程技術(shù)改造衣殼蛋白編碼序列，從而賦予AAV靶向性或提高其基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。已有大量研究證實(shí)，將組織和細(xì)胞靶向性短肽或蛋白質(zhì)編碼序列插入衣殼蛋白編碼序列，經(jīng)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯后形成新的重組AAV衣殼蛋白，可獲得具有特定組織或細(xì)胞靶向性的重組AAV載體[18-19]。AAV衣殼蛋白VP1、VP2和VP3由同一個(gè)啟動(dòng)子P40驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，然后分別在各自起始密碼子引導(dǎo)下翻譯，并最終以1∶1∶10的比例組裝形成病毒衣殼，短肽或蛋白質(zhì)的插入可直接改變衣殼蛋白結(jié)構(gòu)，有可能影響病毒衣殼組裝。因此，插入位點(diǎn)通常在VP2起始密碼子后或VP3編碼區(qū)的非保守區(qū)域(可變區(qū)Ⅳ/Ⅴ/Ⅷ在衣殼蛋白表面形成Loop結(jié)構(gòu)并能夠容納外源性多肽的插入)，從而使得修飾肽段或蛋白暴露在衣殼蛋白表面并位于蛋白親水區(qū)，有利于修飾肽或蛋白介導(dǎo)rAAV的靶向細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。如肌肉細(xì)胞表面高表達(dá)胰島素受體，Jackson等[21]將胰島素受體結(jié)合肽S519編碼序列插入AAV9衣殼蛋白G543(可變區(qū)Ⅳ)和A589(可變區(qū)Ⅷ)位點(diǎn)，產(chǎn)生表面攜帶S519的rAAV9，成功實(shí)現(xiàn)了rAAV9的小鼠肌肉組織靶向基因遞送。

AAV衣殼蛋白具有泛素化、糖基化、乙?；⒘姿峄?、SUMO化等多種翻譯后修飾功能，這些單個(gè)或多個(gè)氨基酸的翻譯后修飾在AAV的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)脫衣殼和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用[22]。AAV1/2/5/7/9和rh10的VP1、VP3蛋白N端具有乙?；揎?，并影響AAV進(jìn)入細(xì)胞核前的降解和脫殼過程[23]。Frederick等[24]對(duì)AAV5衣殼蛋白分別進(jìn)行S2G、S2P、S194P、S194G、S2G+S194G和S2P+S194P點(diǎn)突變。由于將乙?；稽c(diǎn)絲氨酸突變?yōu)楦拾彼岷透彼幔沟肁AV5的VP1、VP3蛋白N端不發(fā)生乙?；?S-P)或乙?；斤@著下降(S-G)，由此可觀察N端乙酰化對(duì)AAV5衣殼蛋白組裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的影響。結(jié)果表明，VP1、VP3蛋白N端乙?；挥绊懸職さ鞍捉M裝，但S194G突變使得AAV5對(duì)小鼠視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞和脈絡(luò)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著增加。2021年，Crosson等[25]對(duì)AAV2衣殼蛋白進(jìn)行V387R、W502H、E530K、L583R點(diǎn)突變使衣殼蛋白疏水性增加，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AAV2的視網(wǎng)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著下降。但如果同時(shí)進(jìn)行AAV2衣殼蛋白R(shí)585A、R588A點(diǎn)突變(AAV2的HSPG受體結(jié)合位點(diǎn))，則顯著提高了AAV2對(duì)小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物恒河猴視網(wǎng)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。因此，突變AAV衣殼蛋白的特定翻譯后修飾位點(diǎn)能夠通過改變其表面電荷性質(zhì)、親/疏水結(jié)構(gòu)等途徑顯著影響AAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、靶向性和遞送基因表達(dá)水平。

2.2 定向進(jìn)化 定向進(jìn)化，即通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)編碼基因突變，產(chǎn)生具有定制特性的蛋白質(zhì)。經(jīng)典的AAV定向進(jìn)化策略包括DNA shuffling、隨機(jī)多肽序列插入和噬菌體展示，由此制備AAV衣殼蛋白編碼序列的隨機(jī)重排序列文庫(kù)，包裝AAV，然后通過多輪體內(nèi)或體外的細(xì)胞和組織感染、富集、篩選步驟，獲得具有定制特性的AAV衣殼[26]。Liu等[27]以AAV1/2/3B/4/6/7/8/9衣殼編碼序列為基礎(chǔ)構(gòu)建DNA shuffling文庫(kù)，以AAV2衣殼編碼序列為基礎(chǔ)構(gòu)建多肽展示文庫(kù)，然后等比例混合兩種文庫(kù)，感染Tie2-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠(由于該小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)GFP，可直接進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選)，通過提取小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選衣殼蛋白編碼序列、建立AAV文庫(kù)、感染小鼠內(nèi)皮細(xì)胞，并將這一過程多輪重復(fù)，最后獲得能夠靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞的AAV 突變體。2020年，De Alencastro等[28]以“Barcode”標(biāo)記AAV文庫(kù)、通過高通量測(cè)序跟蹤定向AAV衣殼的進(jìn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一策略的缺點(diǎn)主要在于：1)隨機(jī)效應(yīng)；2)具有不同衣殼蛋白組成的AAV在轉(zhuǎn)導(dǎo)同一細(xì)胞時(shí)具有競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)；3)AAV文庫(kù)制備中采用的輔助病毒在此過程中將選擇性促進(jìn)文庫(kù)中易復(fù)制AAV的生成。由于該策略是篩選AAV基因組DNA而非mRNA，這種多輪篩選策略反而對(duì)AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)能力形成負(fù)性選擇。為優(yōu)化定向進(jìn)化策略，2021年Tabebordbar等[29]報(bào)道了一種名為 DELIVER(directed evolution of AAV capsids leveraging in vivo expression of transgene RNA)的AAV載體衣殼定向進(jìn)化方法，該方法基于合理性設(shè)計(jì)來制備多樣性衣殼蛋白文庫(kù)，以該AAV文庫(kù)感染小鼠、遞送編碼其自身衣殼蛋白基因并以該衣殼蛋白的mRNA為篩選對(duì)象，由此篩選具有組織特異性和高效轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的rAAV衣殼蛋白序列。該研究具體步驟：在AAV9衣殼蛋白Ⅷ疏水區(qū)第588位和589位氨基酸位點(diǎn)中插入隨機(jī)組成的七肽(以使插入的肽段暴露于衣殼蛋白表面)，構(gòu)建多樣性衣殼蛋白文庫(kù)。將上述插入隨機(jī)組成七肽的衣殼蛋白構(gòu)建于通用啟動(dòng)子(CMV)驅(qū)動(dòng)的質(zhì)粒載體，構(gòu)成多樣性衣殼蛋白編碼基因遞送文庫(kù)。將二者結(jié)合，經(jīng)293T細(xì)胞系包裝、建立遞送編碼其自身衣殼蛋白基因的多樣性衣殼蛋白文庫(kù)后，使用C57BL/6J小鼠進(jìn)行體內(nèi)基因遞送，提取肌肉組織，通過檢測(cè)衣殼蛋白DNA和mRNA篩選出靶向并有效轉(zhuǎn)導(dǎo)肌肉組織的AAV。進(jìn)一步，將篩選獲得的AAV衣殼蛋白編碼序列構(gòu)建于兩種小鼠肌肉組織特異性啟動(dòng)子(CK8、MHCK7)驅(qū)動(dòng)的帶有ITR序列的質(zhì)粒載體作為遞送基因，將其與前述多樣性衣殼蛋白編碼基因遞送文庫(kù)結(jié)合制備rAAV，對(duì)C57BL/6J小鼠進(jìn)行體內(nèi)基因遞送。再次通過相同的衣殼蛋白DNA和mRNA篩選步驟，與前述結(jié)果比對(duì)，該研究成功獲得靶向并有效轉(zhuǎn)導(dǎo)肌肉組織的AAV衣殼蛋白編碼序列(插入該衣殼蛋白的七肽中，前三個(gè)氨基酸為RGD)。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，多樣性衣殼蛋白編碼基因rAAV文庫(kù)感染小鼠的組織中，同一種衣殼蛋白編碼的DNA和mRNA水平并不一致，而轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的mRNA水平是鑒定有效的特異性組織或細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要指標(biāo)。這一結(jié)果表明，基于AAV衣殼蛋白DNA而非mRNA篩選獲得的AAV很可能不具備有效的特異性組織或細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。

2.3 化學(xué)修飾 外源性多肽或蛋白質(zhì)插入通常受到AAV衣殼蛋白插入位點(diǎn)和容量的限制，也常導(dǎo)致AAV衣殼蛋白無法正確組裝，因此限制了合理設(shè)計(jì)策略在AAV衣殼靶向性修飾中的應(yīng)用。為解決上述問題，研究者新近開發(fā)了基于化學(xué)修飾的AAV衣殼靶向性修飾策略，該策略同樣基于合理設(shè)計(jì)，但可通過對(duì)AAV衣殼蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾，使其能結(jié)合靶細(xì)胞特異性受體的配體分子或抗體，從而使AAV具備細(xì)胞靶向性，由此實(shí)現(xiàn)配-受體或抗體介導(dǎo)的AAV靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)。

亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域之間可特異性、高親和力地相互作用形成卷曲螺旋對(duì)，Thadani等[30]利用這一特性，將C端融合腸激酶切割基序的亮氨酸拉鏈卷曲螺旋結(jié)合基序插入AAV9衣殼蛋白G453位點(diǎn)之后，制備亮氨酸拉鏈卷曲螺旋結(jié)合基序修飾衣殼的AAV9病毒。具備該衣殼蛋白的AAV9經(jīng)腸激酶處理后，表面展示線性化的亮氨酸拉鏈卷曲螺旋結(jié)合基序，該AAV9可與互補(bǔ)亮氨酸拉鏈卷曲螺旋結(jié)合基序融合的靶細(xì)胞配體分子特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)配-受體介導(dǎo)的靶向細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。

DNA-蛋白質(zhì)相互作用也可用于AAV靶向性修飾。如蛋白標(biāo)簽HUH能與特定序列單鏈DNA(5’-CCA GTT TCT CGA AGA GAA ACC GGT AAG TGC ACC CTC CCT GAT GA - AmMO-3’)形成共價(jià)鍵結(jié)合。Zdechlik等[31]將分子量21 kU的HUH-tag引入AAV-DJ衣殼的可變區(qū)IV，制備衣殼表面攜帶HUH的AAV-DJ。由于此AAV-DJ可通過其HUH標(biāo)簽與單鏈DNA共價(jià)修飾的任何抗體結(jié)合，從而成為了一種“通用型”靶向AAV。

上述兩種方案盡管提供了制備“通用型”靶向修飾AAV的方法，但仍需要對(duì)衣殼蛋白進(jìn)行基因重組，有可能導(dǎo)致AAV組裝問題。去唾液酸糖蛋白受體 (asialoglycoprotein receptor，ASGP-R)在肝細(xì)胞表面高表達(dá)，可特異性識(shí)別、結(jié)合N-乙酰半乳糖胺。Mével等[32]直接對(duì)AAV2衣殼蛋白賴氨酸殘基的氨基基團(tuán)進(jìn)行N-乙酰半乳糖胺修飾，使AAV2獲得ASGP-R介導(dǎo)的靶向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。

3 結(jié)語和展望

目前多個(gè)臨床試驗(yàn)證明AAV作為治療性基因遞送載體具有顯著的優(yōu)勢(shì)和良好的應(yīng)用前景[33]。但AAV載體的臨床應(yīng)用仍然存在以下問題亟待解決：1) AAV衣殼的固有免疫原性可激活宿主免疫反應(yīng)，影響基因治療的安全性，導(dǎo)致無法重復(fù)給藥，從而影響基因治療的有效性[34-35]；2)AAV載體缺乏靶向性，阻礙體內(nèi)基因治療遞送和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；3)AAV載體具有潛在的宿主基因組整合能力[36]。同時(shí)，對(duì)于AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞的生物學(xué)全過程尚未完全闡明，特別是需要進(jìn)一步鑒定介導(dǎo)AAV黏附、進(jìn)入不同宿主細(xì)胞的受體分子，研究AAV衣殼蛋白激發(fā)宿主免疫反應(yīng)的過程?！皺C(jī)器學(xué)習(xí)”無需物理建?？芍苯踊趯?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練、獲得工程蛋白質(zhì)的全部潛在多樣性序列組成。2021年，Bryant等[37]通過機(jī)器學(xué)習(xí)模擬單個(gè)氨基酸隨機(jī)突變，設(shè)計(jì)了多達(dá)5萬多個(gè)的有功能的野生型AAV2衣殼蛋白變體。同年，Hie等[38]運(yùn)用新的“機(jī)器學(xué)習(xí)”算法處理宿主體內(nèi)流感病毒血凝素、HIV-1包膜糖蛋白和新型冠狀病毒的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定了能夠保護(hù)病毒逃逸免疫系統(tǒng)識(shí)別，同時(shí)保留其感染性的突變。這些新近研究提示，利用已發(fā)現(xiàn)的天然AAV衣殼蛋白編碼序列、衣殼蛋白翻譯后修飾和衣殼蛋白免疫原性位點(diǎn)的信息，通過“機(jī)器學(xué)習(xí)”有望預(yù)測(cè)AAV衣殼蛋白的免疫逃逸突變，以此有效優(yōu)化衣殼序列以改善AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并降低其免疫原性。同樣的，將病毒組裝前后的AAV衣殼文庫(kù)編碼序列數(shù)據(jù)用于“機(jī)器學(xué)習(xí)”算法有望預(yù)測(cè)病毒衣殼組裝，從而對(duì)衣殼蛋白文庫(kù)設(shè)計(jì)進(jìn)行改進(jìn)[39]。

綜上所述，AAV衣殼是激發(fā)宿主免疫反應(yīng)的主要免疫原，同時(shí)決定AAV組織嗜性和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性，因此衣殼蛋白修飾是當(dāng)前AAV載體研究的重點(diǎn)。多種AAV衣殼蛋白修飾的研究策略結(jié)合“機(jī)器學(xué)習(xí)”，有望篩選出能夠重復(fù)給藥并具備靶向性和高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的AAV載體，進(jìn)一步促進(jìn)基因治療的臨床應(yīng)用。