鏈球菌改進(jìn)咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎動物模型的研究

劉承靈，王祎琳，張 璇，王婧宇，仁 丹，柏 佳，趙 華 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 0085； 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 皮膚科，北京 0085； 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新部 醫(yī)院管理研究所，北京 0085

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，主要表現(xiàn)為軀干、四肢散在分布境界清楚的鱗屑性紅斑和丘疹。銀屑病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、自身免疫、環(huán)境等多方面因素[1-2]。銀屑病嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，目前藥物治療無法根治，其機(jī)制研究以及治療方法的探索與評價(jià)是關(guān)注熱點(diǎn)。建立一種便捷、穩(wěn)定且符合臨床病理特點(diǎn)的動物模型非常重要。目前用于研究銀屑病的動物模型大致分為自發(fā)動物模型、轉(zhuǎn)基因動物模型、咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導(dǎo)模型和移植模型，方法眾多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，但都不能完全模擬人體銀屑病的發(fā)病規(guī)律[3]。目前最常用的銀屑病樣皮炎動物模型為咪喹莫特誘導(dǎo)的動物模型，因其操作便捷、相對實(shí)用且皮損及病理表現(xiàn)與臨床銀屑病類似程度高而被廣泛使用。但由于成功造模后維持時(shí)間短，在一定程度上影響疾病機(jī)制研究及治療藥物的效價(jià)評價(jià)[4]。因此一種相對穩(wěn)定延長皮損持續(xù)時(shí)間的模型具有一定意義。臨床上發(fā)現(xiàn)，鏈球菌可導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生及病情加重，通過鏈球菌激發(fā)免疫反應(yīng)從而建立多種免疫相關(guān)炎癥性疾病動物模型(如IgA腎炎、類風(fēng)濕性心瓣膜炎、自身免疫性腦炎)已有報(bào)道[5-10]。故我們采用文獻(xiàn)報(bào)道的感染鏈球菌的方式刺激小鼠誘發(fā)免疫反應(yīng)[11-12]，期待可延長皮損的持續(xù)時(shí)間、加重銀屑病的皮損表現(xiàn)，形成更加穩(wěn)定的動物模型。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6 小鼠 45 只，雌性，SPF級，6 ～ 8 周齡，體質(zhì)量 18 ～ 22 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0010，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：110324210100639426。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)期間自由攝食飲水，控制環(huán)境溫度為18℃～24℃、相對濕度為 40% ～ 70%，明暗交替12 h。所開展的實(shí)驗(yàn)均經(jīng)解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心倫理審查委員會批準(zhǔn)(倫理批號：2021-X17-67)。實(shí)驗(yàn)中涉及的方法均根據(jù)動物實(shí)驗(yàn)相關(guān)指南和法規(guī)進(jìn)行。2 藥品及儀器設(shè)備 二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO公司，日本)，麥?zhǔn)郊?xì)菌比濁儀(齊威儀器有限公司，杭州)，普通離心機(jī)(安亭科學(xué)儀器廠，上海)，小動物氣體麻醉機(jī)(玉研科學(xué)儀器公司，上海)，石蠟旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(輔光精密儀器有限公司，上海)，哥倫比亞血培養(yǎng)基(科碼嘉有限公司，上海)，實(shí)驗(yàn)用異氟烷(上海玉研科學(xué)儀器公司，上海)，咪喹莫特乳膏(3M中國有限公司，上海)，醫(yī)用黃凡士林(vaseline，VAS；解放軍總醫(yī)院藥劑室，北京)，A族β溶血鏈球菌株(group A streptococcus，GAS；北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院BNCC 3371100，北京)，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS；普諾賽，武漢)，小鼠白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(江萊生物公司，JL20250、JL20257、JL20268，上海)，Ki-67抗體(Abcam公司，ab15580，美國)。

3 銀屑病模型的建立及小鼠分組處理 1)細(xì)菌準(zhǔn)備：將A族β溶血鏈球菌株充分活化，鋪滿整個血培養(yǎng)基，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中12 h后，進(jìn)行顯微鏡下菌株鑒定。確定擴(kuò)增成功后，從母板上取一接種環(huán)的細(xì)菌在新的肉湯液體培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)增，然后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。16 h后離心過濾收集液體培養(yǎng)基中的菌落，采用比濁法測定細(xì)菌的數(shù)目，用PBS溶液配置終濃度為 2 × 1010CFU/mL 的細(xì)菌溶液。2)動物準(zhǔn)備：小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為鏈球菌組 (GAS + IMQ)、咪喹莫特組 (PBS + IMQ)和空白組 (PBS + VAS)，每組15只。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，每只小鼠背部皮膚用電動剃毛器刮除2 cm ×3 cm大小矩形毛發(fā)。造模第1天，鏈球菌組小鼠每只鼻孔接種配置好的細(xì)菌菌液，每側(cè)5 μL，咪喹莫特組、空白組小鼠每側(cè)鼻孔接種等量PBS溶液。3)動物處理：造模第3天起，空白組每日在小鼠背部涂抹醫(yī)用凡士林；鏈球菌組、咪喹莫特組每日在小鼠背部涂抹咪喹莫特乳膏62.5 mg/(2 ×3 cm2·d)后充分按摩，持續(xù)涂抹 21 d。每組在造模的第0、3、10、17、24天隨機(jī)處死3只老鼠并留取皮損組織標(biāo)本，背部皮膚組織用10%甲醛緩沖液常溫保存。造模第24天采取摘眼球取血法留取每只小鼠血液標(biāo)本 0.5～1 mL，3 000 r/min 離心15 min，取上清待測。

4 皮損評分 參考銀屑病皮損面積及嚴(yán)重程度指數(shù) (psoriasis area and severity index，PASI)評估皮損的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)第3天開始，每日對皮損的紅斑、鱗屑、厚度進(jìn)行評分，并將3項(xiàng)得分相加得到總分。PASI評分標(biāo)準(zhǔn)：紅斑，0分為無紅斑，1分為紅斑呈淡紅色，2分為紅斑呈紅色，3分為紅斑呈深紅色，4分為紅斑極深；鱗屑，0分為表面無鱗屑，1分為部分皮損表面上覆有鱗屑，2分為大多數(shù)皮損表面覆蓋有鱗屑，3分為皮損部位幾乎全部被鱗屑覆蓋且鱗屑呈層狀，4分為皮損部位全部被鱗屑覆蓋；厚度，0分為皮損與正常皮膚齊平，1分為皮損較正常皮膚表面稍高，2分為皮損中等度隆起，3分為皮損肥厚且隆起明顯，4分為皮損高度肥厚且明顯凸起。各組總分取平均值繪制曲線。

5 小鼠皮損組織病理及大體觀察 每日對小鼠皮損進(jìn)行拍照留存，將留存的三組小鼠背部皮損組織固定于10%甲醛溶液中，經(jīng)標(biāo)本脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色。顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)。

6 ELISA 檢測小鼠血清中 IL-17、IL-6、TNF-α 的表達(dá) 將獲取的待測血清標(biāo)本按照試劑盒的說明書進(jìn)行細(xì)胞因子濃度的測定，在IL-17、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子檢測板中加入樣本(稀釋5倍)或?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品并設(shè)置對照，加檢測抗體孵育，洗板，加酶孵育，洗板，加入顯色劑顯色反應(yīng)5 ～30 min后，加終止液使反應(yīng)終止，10 min內(nèi)在酶標(biāo)儀設(shè)置參考波長 610 ～ 630 nm，檢測波長 450 nm，測出各孔吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各細(xì)胞因子的含量。

7 免疫組化檢測小鼠皮膚中 Ki-67 的表達(dá) 將留存的各組小鼠皮損組織石蠟切片脫蠟水化，封閉，加抗原修復(fù)液進(jìn)行冷修復(fù)，一抗4℃孵育過夜。次日室溫放置30 min后，先滴加反應(yīng)增強(qiáng)液室溫反應(yīng)10 min，后滴加二抗，室溫反應(yīng)20 min，DAB 顯色 5 ～ 8 min，蘇木精復(fù)染 20 s，脫水，封片，顯微鏡觀察Ki-67的表達(dá)情況。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 Graphpad Prism 8 和 SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖片繪制，使用iViewer軟件觀察測量HE組織標(biāo)本表皮厚度，使用Image J軟件計(jì)算免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本Ki-67陽性細(xì)胞比例。觀測資料均為計(jì)量資料，以±s表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠皮膚大體形態(tài)觀察及皮損 PASI 評分 第0 ～ 3天三組小鼠皮膚均光滑平整(圖1)。與空白組相比，鏈球菌組、咪喹莫特組小鼠在第4天即出現(xiàn)輕微鱗屑，皮膚微發(fā)紅；隨后鱗屑增多，皮損面積蔓延擴(kuò)大，部分紅斑表面覆厚重鱗屑，紅斑顏色加深；PASI評分開始上升(圖2)，鏈球菌組評分高于同期咪喹莫特組。鏈球菌組和咪喹莫特組小鼠第10天鱗屑布滿背部皮膚，上覆厚重鱗屑，紅斑呈深紅色。皮損PASI評分達(dá)到頂峰。咪喹莫特組小鼠第10天后皮損鱗屑面積開始減少，厚度減小，紅斑顏色減退，第17天鱗屑進(jìn)一步減少伴少量淡紅斑，第24天僅見部分菲薄的鱗屑。鏈球菌組第10 ~ 24天皮損保持較為穩(wěn)定，同期皮損PASI評分均顯著高于咪喹莫特組(P＜0.05)。

圖1 小鼠實(shí)驗(yàn)造模第 0、3、10、17、24 天背部皮損情況Fig.1 Skin lesions of mice on day 0, 3, 10, 17, 24

圖2 小鼠不同時(shí)間點(diǎn)背部皮損PASI評分(aP＜0.05，vs PBS+IMQ)Fig.2 PASI scores of dorsal skin lesions in mice at specific time points (aP＜0.05, vs PBS+IMQ)

2 小鼠皮膚組織病理及表皮厚度改變 第 0、3天鏈球菌組和咪喹莫特組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)大致正常。第10天鏈球菌組和咪喹莫特組表皮均明顯增厚，伴角化不全、角化過度、炎性細(xì)胞浸潤、顆粒層變薄、棘突延長等。第17 ~ 24天咪喹莫特組表皮厚度明顯減小，鏈球菌組表皮厚度減小不明顯。見圖3、圖4。

圖3 小鼠實(shí)驗(yàn)造模第 0、3、10、17、24 天皮損組織病理 (HE，200×)Fig.3 Histopathological changes of skin lesions in mice on day 0, 3, 10, 17, 24 (HE, 200×)

圖4 小鼠實(shí)驗(yàn)造模第 0、3、10、17、24 天表皮厚度比較 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)Fig.4 Comparison of epidermis thickness in mice on day 0, 3, 10,17, 24 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)

3 實(shí)驗(yàn)第 24 天小鼠血清 TNF-α、IL-17、IL-6 表達(dá)水平 造模第24天，與空白組相比，鏈球菌組和咪喹莫特組小鼠血液中IL-17和IL-6、TNF-α含量均升高，且鏈球菌組均顯著高于咪喹莫特組(P＜0.05)。鏈球菌組與空白組 TNF-α、IL-6 、IL-17 細(xì)胞因子水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖5。

圖5 實(shí)驗(yàn)第24天小鼠血清TNF-α、IL-17、IL-6表達(dá)水平 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)Fig.5 Expression levels of TNF-α, IL-17, IL-6 in sera of mice on day 24 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)

4 造模第 24 天小鼠背部皮損組織 Ki-67 表達(dá)造模第24天，鏈球菌組小鼠皮膚基底層Ki-67陽性細(xì)胞百分率顯著高于咪喹莫特組和空白組(35.23%±3.26%vs24.30%±4.23%、13.73%±1.50%，P均＜0.05)。見圖6。

圖6 實(shí)驗(yàn)第24天小鼠背部皮膚Ki-67陽性表達(dá)A:免疫組織化學(xué)染色(200×)；B:Ki-67陽性率(aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)Fig.6 Expression level of Ki 67 in mice dorsal skin of each group on day 24 A: immunohistochemistry staining (200×); B: Ki-67 positive percentage (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)

討 論

銀屑病是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性疾病，可見于任何年齡段人群，常反復(fù)發(fā)作，亞洲成年人發(fā)病率約為0.14%[13]。主要炎癥通路為IL-23/Th17軸的異常激活。銀屑病患者皮損中可見數(shù)量不等的中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤；在銀屑病患者血清中可發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6、IL-17等細(xì)胞因子明顯升高，說明多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與Th17為主的免疫反應(yīng)[14-16]。銀屑病動物模型主要分為轉(zhuǎn)基因動物模型、咪喹莫特誘導(dǎo)模型、異體移植模型等。轉(zhuǎn)基因模型皮損表達(dá)較為穩(wěn)定，但不能很好地模擬銀屑病的發(fā)病規(guī)律且造價(jià)昂貴；異體移植模型因造模困難，條件苛刻而受限[3]。目前研究銀屑病主要采用咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎動物模型。咪喹莫特是一種Toll樣受體激動劑，可特異性激活Toll-7/8受體，促進(jìn)γ干擾素產(chǎn)生，刺激樹突狀細(xì)胞激活Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)從而模擬銀屑病樣皮損，皮損在第7天左右最嚴(yán)重，1周后逐漸消退，給研究帶來不便[17-18]。Horváth等[19-20]使用小型斑貼器改良動物模型，該模型可減少咪喹莫特的使用量，有效減少藥物經(jīng)皮吸收后對動物全身的不良影響。修緩娟等[21]通過皮下注射IL-12和脂多糖的方法，延長銀屑病小鼠模型持續(xù)時(shí)間。

GAS是一種革蘭陽性球菌，可在人體扁桃體中大量定植。研究發(fā)現(xiàn)GAS感染引發(fā)的免疫反應(yīng)與IgA腎炎、類風(fēng)濕心瓣膜炎、自身免疫性腦炎等免疫疾病密切相關(guān)，鏈球菌感染誘導(dǎo)的上述疾病動物模型已被廣泛應(yīng)用[5-10]。Groot等[22]的大樣本隊(duì)列研究顯示，鏈球菌的感染與點(diǎn)滴型銀屑病發(fā)生和慢性斑塊型銀屑病癥狀加重相關(guān)，并可以通過抗感染治療銀屑病。GAS主要通過其菌壁上的超抗原如M蛋白、制熱素蛋白、熱休克蛋白以及細(xì)菌內(nèi)的甲基化DNA等作為抗原刺激并誘發(fā)T細(xì)胞相關(guān)免疫反應(yīng)[23-24]。Ferran等[25]發(fā)現(xiàn)鏈球菌可特異性激活皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原T細(xì)胞產(chǎn)生Th1、Th17類型的細(xì)胞因子參與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖。Wang等[26]研究證實(shí)鏈球菌可以通過激活Toll-2受體以及產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子β從而激活Th17免疫反應(yīng)，在細(xì)胞水平上證實(shí)感染鏈球菌后機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)與銀屑病發(fā)病通路高度類似。

本研究以鏈球菌感染小鼠從而改良銀屑病樣皮炎動物模型[11-12]，使其皮損表現(xiàn)更顯著、更穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間更長。從小鼠大體皮損、PASI評分、皮損組織病理及表皮厚度等可看出，感染鏈球菌的小鼠皮損持續(xù)時(shí)間延長，皮損表現(xiàn)更典型、更穩(wěn)定。反映炎癥程度的細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-17在鏈球菌組中明顯升高，說明鏈球菌感染小鼠的炎癥程度更為劇烈。Ki-67是一種反映細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)，是銀屑病中增殖活性的經(jīng)典標(biāo)志物[27]。免疫組化結(jié)果顯示，鏈球菌組小鼠基底層細(xì)胞增殖更活躍。綜上提示鏈球菌可能通過角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖加重銀屑病樣皮損。另外本實(shí)驗(yàn)中還觀察到銀屑病樣皮炎小鼠模型在連續(xù)涂抹咪喹莫特后皮膚顏色變黑，鼠毛生長更為旺盛，提示長期外用咪喹莫特可能對老鼠皮膚及毛發(fā)生長有影響，但有待進(jìn)一步證實(shí)與研究。

本研究以鏈球菌感染的方式改良銀屑病樣皮炎動物模型，此前未見報(bào)道。對比傳統(tǒng)模型，鏈球菌感染的銀屑病樣皮炎動物模型皮損表現(xiàn)更典型、更穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間更長。但本研究未探討其具體機(jī)制，亟待后期研究加以完善。綜上，鏈球菌感染可改良銀屑病樣皮炎動物模型，可能是一種可行且具備良好效果的動物模型。