牛皮蠅幼蟲(chóng)蛋白表達(dá)譜及一種高表達(dá)蛋白的分離純化

付 偉，李鵬飛，婁亞南，金素鈺，黃 林，林亞秋，鄭玉才

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

牛皮蠅蛆?。℉ypodermosis）是一種世界范圍內(nèi)存在的動(dòng)物疾病，能感染家養(yǎng)和野生反芻動(dòng)物，感染率很高［1-2］，其病原主要是雙翅目、皮蠅科、皮蠅屬的牛皮蠅（Hypodermabovis）和紋皮蠅（Hypoder-malineatum），而國(guó)內(nèi)病原主要為中華皮蠅（Hypodermasinense），約占牦牛（Bosgrunniens，yak）感染率的90%［2］。由于牛皮蠅蛆病可嚴(yán)重影響畜牧業(yè)生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)該病開(kāi)展了不少基礎(chǔ)和防控方面的研究，包括流行病學(xué)分析 、牛皮蠅鑒定和分子生物學(xué)［2-5］及防控措施［6-7］。本課題組對(duì)牦牛皮下寄生的中華皮蠅幼蟲(chóng)乳酸脫氫酶進(jìn)行了分離純化，發(fā)現(xiàn)該酶為特殊的單體酶，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，米氏常數(shù)與其他動(dòng)物存在差異［8］。

為全面了解牛皮蠅幼蟲(chóng)的蛋白表達(dá)特征，本研究對(duì)感染牦牛的牛皮蠅二期或三期幼蟲(chóng)總蛋白進(jìn)行電泳分析，闡明其蛋白表達(dá)譜的個(gè)體差異，同時(shí)利用雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)，試圖鑒定一些差異表達(dá)蛋白，為牛皮蠅蛆病的診斷和防控提供新的線索。本研究還利用分子篩和離子交換層析，純化了在牛皮蠅幼蟲(chóng)中一種高表達(dá)的蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集和鑒定 牛皮蠅二期或三期幼蟲(chóng)采自四川省青白江區(qū)某屠宰場(chǎng)，牦牛（n＝5）屠宰后從皮下采集幼蟲(chóng)（n＝53），經(jīng)生理鹽水清洗后用干冰帶回實(shí)驗(yàn)室，置-80℃凍存。用Otranto D等［4-5］建立的PCR-RFLP方法，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室牦牛皮蠅幼蟲(chóng)快速鑒定方法對(duì)采集的牛皮蠅進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，所有樣品均為中華皮蠅（H.sinense）幼蟲(chóng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 固相pH梯度膠條（pH3～10，非線性）、丙磺酸（CHAPS）、碘乙酰胺、Bio-Lyte 3／10、二硫蘇糖醇（DTT）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、尿素，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；苯甲基磺酰氟（PMSF），美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；ProteanⅡxi cell垂直電泳槽、Protean IEF cell等電聚焦系統(tǒng)、Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)及 PDQuest Version 7.0.1軟件，Bio-Rad公司產(chǎn)品；組織勻漿器，美國(guó)Wheaton公司產(chǎn)品；CR21G高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司產(chǎn)品；Biowave紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，英國(guó)Biochrom公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 牛皮蠅幼蟲(chóng)總蛋白提取 牛皮蠅幼蟲(chóng)測(cè)量體長(zhǎng)和稱重后，加入10倍體積勻漿液（0.02mol／L Tris-HCl，pH 7.5；0.001mol／L PMSF），用電動(dòng)勻漿器在冰上勻漿30s，10 000r／min于4℃離心20min，上清液分裝并保存于-80℃，用Bradford法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 牛皮蠅幼蟲(chóng)蛋白的電泳分離 取上述蛋白抽提液加入等體積的上樣緩沖液，煮沸5min后，用分離膠濃度為125g／L的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，每孔上樣6μg蛋白質(zhì)。電泳條件為：60V電泳50min，然后120V電泳至指示劑接近凝膠底部。凝膠用1g／L考馬斯亮藍(lán)R-250染色50min，脫色后保存于70g／L冰乙酸中。

1.2.3 牛皮蠅幼蟲(chóng)中一種高表達(dá)蛋白的純化 將包含一種高表達(dá)蛋白的牛皮蠅幼蟲(chóng)勻漿液混合（5mL），采用Superdex 75分子篩層析進(jìn)行2次分離（第2次上樣前洗脫樣品須凍干濃縮），層析柱規(guī)格為1cm×20cm，洗脫液為0.02mol／L Tris-HCl（pH 7.5），在 AKTA prime低壓層析儀上完成。洗脫液凍干濃縮后，上High Q陰離子交換層析（Bio-Rad預(yù)裝柱），用含1mol／L NaCl的上述緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.4 牛皮蠅幼蟲(chóng)蛋白的雙向電泳分離 選取SDS-PAGE圖譜差異極大的10號(hào)和14號(hào)牛皮蠅幼蟲(chóng)勻漿液進(jìn)行雙向電泳。采用固相pH梯度膠條（pH3～10，非線性）進(jìn)行等電聚焦，每根膠條蛋白上樣500μg，蛋白液和水化液共300μL（7mol／L尿素，2mol／L硫脲，40g／L CHAPS，65mmol／L二硫蘇糖醇，2g／L Bio-lyte，0.01g／L溴酚藍(lán)），上樣方法為膠條20℃主動(dòng)泡脹14h。聚焦條件為：恒溫20℃下，250V3h（慢），500V1h（慢），1 000V1 h（慢），5 000V3h（快），10 000V6h。

等電聚焦結(jié)束后，膠條分別在平衡緩沖液Ⅰ（6mol／L尿素，20g／L SDS，0.375mol／L pH 8.8 Tris-HCl，200mL／L甘油，20g／L二硫蘇糖醇）和平衡緩沖液Ⅱ（25g／L碘乙酰胺代替緩沖液Ⅰ中的20g／L二硫蘇糖醇）中進(jìn)行平衡，每次15min。用分離膠濃度為125g／L的SDS-PAGE進(jìn)行第二向分離，電泳條件為：16mA／膠條30min，恒壓200V電泳直至溴酚藍(lán)指示劑接近凝膠底部。1g／L的考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色后保存于70g／L冰乙酸中。

凝膠用Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)拍照獲取圖譜，再用PDQuest 7.1進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)、背景消減、匹配、強(qiáng)度比較等。用滅菌槍頭將需要鑒定的蛋白點(diǎn)挖出，送深圳華大基因進(jìn)行MALDI-TOF-TOF串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。以雙翅目中的果蠅（Drosophilamelanogaster）為搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置參數(shù)后用Mascot軟件對(duì)獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索和鑒定。

2 結(jié)果

2.1 牛皮蠅幼蟲(chóng)總蛋白SDS-PAGE

牛皮蠅幼蟲(chóng)（n＝53）總蛋白在SDS-PAGE上能獲得較好分離（圖1），不同個(gè)體間蛋白表達(dá)譜存在不同程度差異，其中共有12個(gè)樣品表現(xiàn)出含有一種高豐度蛋白（如圖1中3、7、8泳道箭頭位置），分子質(zhì)量約為78ku。

圖1 牛皮蠅幼蟲(chóng)蛋白抽提液SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of protein extract of Hypodermalarvae

2.2 牛皮蠅幼蟲(chóng)中一種高表達(dá)蛋白的純化

牛皮蠅幼蟲(chóng)勻漿液經(jīng)離子交換和分子篩層析分離后，其中的一種分子質(zhì)量約為78ku的高表達(dá)蛋白質(zhì)獲得了有效分離（如圖2中9泳道箭頭位置），電泳純的蛋白質(zhì)可用于進(jìn)一步的分析、抗體制備等。

2.3 牛皮蠅幼蟲(chóng)蛋白的雙向電泳分析

牛皮蠅幼蟲(chóng)10號(hào)和14號(hào)樣品總蛋白的SDSPAGE圖譜差異極大（圖3A），進(jìn)一步用雙向電泳對(duì)其進(jìn)行分離，獲得了分辨率和重復(fù)性較好的電泳圖譜（圖3B、圖3C）。軟件分析顯示，兩個(gè)樣品分別有312±24個(gè)和284±13個(gè)點(diǎn)得到分離。對(duì)其中的4個(gè)蛋白點(diǎn)（8、11、13、14）進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果未得到分?jǐn)?shù)高的匹配結(jié)果。

圖2 牛皮蠅幼蟲(chóng)中一種高表達(dá)蛋白的純化Fig.2 Purification of a high expression protein in Hypodermalarvae

圖3 牛皮蠅幼蟲(chóng)總蛋白電泳圖譜Fig.3 The electrophoretic profile of Hypodermalarva total protein

3 討論

牛皮蠅蛆病一直是制約我國(guó)牦牛飼養(yǎng)業(yè)的主要疫病之一，其中又以中華皮蠅的危害最為嚴(yán)重。有研究表明，在藏區(qū)患皮蠅蛆病的牦牛中，大約有90%都是由于中華皮蠅的感染，而牛皮蠅和紋皮蠅感染率各只占約5%［2］。中華皮蠅不僅寄生于牦牛體內(nèi)，同時(shí)也侵害人和藏羚羊等哺乳動(dòng)物，極大地威脅著人和牲畜的健康［9-10］。

研究顯示，機(jī)體不同發(fā)育時(shí)期，其蛋白質(zhì)表達(dá)種類和數(shù)量存在差異［11-12］。本試驗(yàn)中牦牛皮蠅幼蟲(chóng)總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體蛋白質(zhì)表達(dá)譜存在不同程度差異，但大多數(shù)個(gè)體的蛋白條帶位置和數(shù)量相似，提示在牛皮蠅幼蟲(chóng)發(fā)育的二期或三期，其蛋白質(zhì)表達(dá)量雖然存在明顯差異，但種類可能差異不大。利用ELISA和 Western blot等技術(shù)檢測(cè)牲畜體內(nèi)特定蛋白，可用于牛皮蠅蛆病的早期檢測(cè)和預(yù)防［13］。本試驗(yàn)利用Superdex 75分子篩層析并結(jié)合離子交換層析純化了一種分子質(zhì)量約為78ku的高表達(dá)蛋白，為探索該蛋白與牛皮蠅幼蟲(chóng)發(fā)育的關(guān)系和進(jìn)一步研究牛皮蠅蛆病的感染、診斷及治療提供了一定的線索。

基于雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)已應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域［14-16］，但有關(guān)牦牛皮蠅幼蟲(chóng)總蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)總蛋白差異較大的兩樣品進(jìn)行雙向電泳，獲得了分離效果較好的蛋白質(zhì)圖譜，但質(zhì)譜鑒定并未得到分?jǐn)?shù)較高的蛋白質(zhì)，推測(cè)其原因可能與利用果蠅數(shù)據(jù)庫(kù)搜索蛋白質(zhì)信息有關(guān)，因?yàn)楣壟c牛皮蠅親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)序列可能存在較大差異。本試驗(yàn)成功分離了牛皮蠅二期或三期幼蟲(chóng)總蛋白，為進(jìn)一步研究其蛋白質(zhì)組學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

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