ROS對(duì)子宮內(nèi)膜崩解的作用

劉書(shū)言，武 斌，陳西華，賀 斌，王樹(shù)芳，，劉建兵，，徐祥波＊，王介東

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530021；2.山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院，山東濟(jì)南250000；3.國(guó)家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京100081；4.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京100730）

子宮內(nèi)膜在每一個(gè)月經(jīng)周期中發(fā)生著快速的崩解和脫落，這也是靈長(zhǎng)類動(dòng)物獨(dú)特的生理現(xiàn)象。孕酮撤退是子宮內(nèi)膜崩解脫落的始動(dòng)因素，但其下游的信號(hào)通路仍未闡述清楚。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）在女性生殖系統(tǒng)的生理過(guò)程具有重要的作用。細(xì)胞內(nèi)的ROS有3種主要的類型，即超氧離子（·O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）和氫氧離子（OH）［1］。許多研究顯示，生理水平的ROS在女性生殖的生理過(guò)程，例如排卵、卵子成熟、黃體的活性、胚胎著床以及母胎的發(fā)育過(guò)程中，通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑而發(fā)揮至關(guān)重要的作用［2-4］。

在人的月經(jīng)周期的分泌晚期，總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、Cu-SOD 和 Mn-SOD 的表達(dá)顯著降低，而脂質(zhì)體過(guò)氧化物的表達(dá)則顯著增加［5］。這些結(jié)果提示生理水平的ROS在月經(jīng)的調(diào)節(jié)方面可能起著重要的作用。ROS來(lái)源于炎癥細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞［6］，有報(bào)導(dǎo)顯示，這些細(xì)胞在月經(jīng)發(fā)生前大量浸潤(rùn)到子宮內(nèi)膜中而影響子宮內(nèi)膜的崩解和修復(fù)［7］。

月經(jīng)機(jī)制的研究在一定程度上受限于缺少合適的動(dòng)物模型，而人活體干預(yù)操作也會(huì)受限。小鼠月經(jīng)樣模型在一定程度上避免了這樣的限制。小鼠生理性孕酮撤退月經(jīng)模型首次于1984年建立［8］，且在30年后被澳大利亞的研究小組優(yōu)化［9］。本研究小組利用藥物米非司酮，在孕酮受體水平拮抗孕酮的作用，建立了小鼠藥理性孕酮撤退月經(jīng)模型［10］，小鼠生理性和藥理性孕酮撤退月經(jīng)樣模型的建立為月經(jīng)機(jī)制的研究提供了有價(jià)值的技術(shù)平臺(tái)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)生理水平的ROS在小鼠月經(jīng)樣模型中對(duì)子宮內(nèi)膜的崩解具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性C57小鼠（8周齡～12周齡），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠在可控的條件下飼養(yǎng)（光照從6：00到18：00；溫度21°C±1°C），并給予充足的飲水和食物。所有試驗(yàn)和手術(shù)步驟都由國(guó)家人口計(jì)劃生育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

1.1.2 藥品 內(nèi)雌二醇（E2），Alfa Aesar Inc公司產(chǎn)品；孕酮（P4），Sigma-Aldrich Inc公司產(chǎn)品；花生油，山東魯花公司；組織超氧陰離子色度法定量測(cè)定試劑盒，美國(guó) Gen Med Scientifics Inc公司產(chǎn)品；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC），Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠月經(jīng)樣模型的建立 小鼠月經(jīng)樣模型的建立根據(jù)以往的研究報(bào)導(dǎo)進(jìn)行［9］。具體方法如下：小鼠在麻醉下行雙側(cè)卵巢切除，恢復(fù)2周以清除體內(nèi)E2和P4，然后進(jìn)行以下操作：去勢(shì)小鼠在第1、2、3天的9：30皮下注射E20.37nmol；在第4～6天不做處理；在第7天的9：30，皮下注射 P40.16 nmol和E20.02nmol，并將P4硅膠管埋植于小鼠背部皮下；在第8、9天的9：30分別皮下注射E2 0.02nmol，在第9天的11：30，將20μL花生油注射雙側(cè)子宮角以誘導(dǎo)蛻膜化。49h后（即在第11天的11：30）去除P4皮埋管（記為P4撤退0h），所有的處理組小鼠和對(duì)照組小鼠在P4撤退的0、8、12、16、24h（n＝15-20只／時(shí)間點(diǎn)）處死，收集子宮以進(jìn)行組織形態(tài)和ROS含量的檢測(cè)。

1.2.2 ROS含量的檢測(cè) 子宮中ROS的檢測(cè)使用以氮藍(lán)四唑（NBT）染色的組織超氧陰離子色度法定量測(cè)定試劑盒。稱取100mg冰凍子宮組織，洗滌緩沖液清洗1次，并用虹膜剪將組織樣本剪成小塊；加入500μL裂解液，旋渦振蕩5s，冰上勻漿樣品；BCA法測(cè)定勻漿液蛋白濃度；轉(zhuǎn)移50μL的勻漿物（測(cè)試孔）和稀釋液（空白）到96孔板中；每孔分別加入50μL的染色液，并輕輕混合；37℃孵育30min，用酶標(biāo)儀測(cè)定580nm處吸光度，根據(jù)以下公式計(jì)算樣本濃度：ROS（μmol·L／mg）＝［（ΔA）（0.1）（Df）／［（20）（0.05）］／C 其中 ΔA ＝ A（測(cè)試組）-A（空白）；0.1為體系容量；Df樣品稀釋倍數(shù)；20為NBT反應(yīng)產(chǎn)物在580nm處的摩爾吸光系數(shù)；0.05為樣本的體積；C為樣本的蛋白濃度。

1.2.3 抗氧化劑NAC干預(yù)小鼠月經(jīng)樣模型 小鼠模型按照上述方法建立，小鼠在第11天11：30（孕酮撤退的1h）分別以不同劑量的NAC（200、350、500mg／kg溶于無(wú)菌的PBS）腹腔注射小鼠。隨后去除孕酮皮埋管，且NAC分別在孕酮撤退的3、7、11h進(jìn)行干預(yù)，對(duì)P4撤退的0、8、16、24h行陰道細(xì)胞學(xué)涂片檢查，在不同時(shí)間點(diǎn)收集子宮用于組織形態(tài)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠月經(jīng)樣模型的建立

在小鼠月經(jīng)樣模型中，在孕酮撤退的0h到24 h子宮內(nèi)膜經(jīng)歷了局部壞死到子宮內(nèi)膜完全崩解的過(guò)程。在0h，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化充分且完好（圖1A）。在8h，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化進(jìn)一步發(fā)展，腔上皮下的基質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)局部壞死現(xiàn)象（圖1B）。在12h和16h，壞死的基質(zhì)細(xì)胞增加，且面積進(jìn)一步擴(kuò)大（圖1C，D）。在24h，蛻膜化的基質(zhì)細(xì)胞完全壞死且整個(gè)壞死的蛻膜化區(qū)域從基底層脫落至宮腔（圖1E）。陰道細(xì)胞學(xué)涂片顯示，在24h，大量紅細(xì)胞存在，提示子宮出血（圖1F）。

2.2 小鼠月經(jīng)樣模型ROS的含量

對(duì)ROS在小鼠月經(jīng)樣模型子宮內(nèi)膜崩解過(guò)程中的含量進(jìn)行檢測(cè)。在孕酮撤退的0h（孕酮撤退之前）和8h，ROS的含量很低，在12h的含量顯著增加，在16h即子宮內(nèi)膜崩解的早期達(dá)到最大值，在24h，ROS的含量顯著降低。ROS在12h～24h與0h相比，其含量顯著增加（P＜0.05），ROS在崩解期（特別是16h～24h）含量的增加，提示生理水平的ROS對(duì)月經(jīng)發(fā)生的過(guò)程至關(guān)重要（圖2）。

圖1 孕酮撤退的24h子宮內(nèi)膜崩解狀況和陰道細(xì)胞學(xué)涂片F(xiàn)ig.1 The status of endometrial breakdown and vaginal smear at 24hafter P4withdrawal

圖2 孕酮撤退的0h～24h子宮中ROS的含量Fig.2 The levels of ROS in the uterus from 0hto 24hafter P4withdrawal

2.3 ROS拮抗劑NAC處理對(duì)子宮內(nèi)膜崩解的影響

在200mg／kg NAC處理組中，陰道細(xì)胞學(xué)涂片顯示，在16h和24h的小鼠子宮出血百分比分別是88.9%和100%，與對(duì)照組出血陽(yáng)性小鼠百分率相同（88.9% 和 100%）。在 350mg／kg 和 500mg／kg NAC處理組中，陰道細(xì)胞學(xué)涂片顯示，在16h和24h的小鼠子宮出血率分別為22.2%以及14.3%和28.6%。紅細(xì)胞數(shù)目評(píng)估顯示350mg／kg和500 mg／kg NAC均減少了小鼠子宮出血程度（表1）。

在200mg／kg NAC處理組中，子宮大體呈現(xiàn)暗紅色（圖3A），提示子宮在此處理組出現(xiàn)出血現(xiàn)象。組織形態(tài)學(xué)顯示，中間蛻膜化的子宮基質(zhì)細(xì)胞完全壞死并脫落至宮腔（圖3B、C）。對(duì)照組子宮也同樣呈現(xiàn)暗紅色（圖3D），提示子宮出血，組織形態(tài)學(xué)顯示子宮內(nèi)膜同樣出現(xiàn)崩解現(xiàn)象（圖3E、F）。這些結(jié)果顯示，200mg／kg NAC并沒(méi)有抑制子宮內(nèi)膜的崩解和脫落。在350mg／kg和500mg／kg NAC處理組中，子宮呈現(xiàn)淡粉色（圖3G、J），提示子宮蛻膜化后并未出現(xiàn)出血現(xiàn)象。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，在這兩個(gè)濃度的NAC處理中，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化充分，且大部分細(xì)胞狀態(tài)良好，僅有腔上皮下少數(shù)的基質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)壞死現(xiàn)象（圖3H、I、K、L）。

表1 不同劑量NAC對(duì)小鼠陰道出血程度的比較Table 1 The comparison of the effect of different dose of NAC on the vaginal bleeding

圖3 不同劑量NAC（200mg／kg、350mg／kg和500mg／kg）對(duì)孕酮撤退24h的子宮大體和組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.3 Effects of various NAC doses（200mg／kg，350mg／kg and 500mg／kg）on the endometrial breakdown at 24hafter P4withdrawal

3 討論

在本研究中，我們從陰道細(xì)胞學(xué)涂片、子宮大體和組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，生理水平的ROS對(duì)子宮內(nèi)膜的崩解至關(guān)重要。據(jù)我們所知，這是ROS在月經(jīng)發(fā)生中作用的首次報(bào)道。

在我們的研究中，應(yīng)用NAC來(lái)研究ROS在月經(jīng)發(fā)生中的作用。NAC通過(guò)抗氧化或者消除氧化自由基以增加細(xì)胞內(nèi)GSH的含量（清除ROS酶的底物），因此，NAC被認(rèn)為是重要的抗氧化劑，并被廣泛用于研究ROS在不同生理和病理過(guò)程中的作用［9］。

在本研究中，24h的陰道涂片、子宮大體和組織形態(tài)學(xué)3個(gè)方面顯示，在24h，NAC完全抑制小鼠月經(jīng)樣模型中子宮內(nèi)膜的崩解。實(shí)際上，在腔上皮下有少量的壞死，這是局部壞死的表型，而與子宮內(nèi)膜的崩解關(guān)系不大［9］。這些結(jié)果顯示，ROS是子宮內(nèi)膜崩解的關(guān)鍵因素之一。孕酮撤退是月經(jīng)發(fā)生的起始觸發(fā)因素，本研究結(jié)果顯示，ROS是孕酮撤退下游信號(hào)通路。事實(shí)上，ROS在月經(jīng)發(fā)生中的作用已有既往提示性報(bào)導(dǎo)。在人的月經(jīng)周期中，從增殖期到中泌期，總SOD、Cu、Zn-SOD和 Mn-SOD在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)增加，而在分泌晚期的表達(dá)降低，與此同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量增加。因此，提示ROS對(duì)月經(jīng)的發(fā)生起作用［5］。在本研究中，生理水平的ROS從孕酮撤退的12h到24h顯著增加，特別是在子宮內(nèi)膜崩解前的12h到16h顯著增加，這相當(dāng)于人的分泌晚期，因此，ROS在小鼠月經(jīng)樣模型中的作用也極有可能出現(xiàn)在人月經(jīng)中。

一般來(lái)說(shuō)，好氧系統(tǒng)產(chǎn)生的ROS被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞有毒性作用。然而最近的研究顯示，氧自由基介導(dǎo)了生物的一系列重要的生理事件［11-12］。目前，生理水平的ROS在女性的生理過(guò)程例如排卵和黃體功能具有重要的調(diào)控作用［13-14］。本研究清晰的闡述了ROS在月經(jīng)發(fā)生中的作用，因此ROS對(duì)生理和病理過(guò)程均有重要作用。

綜上所述，ROS是子宮內(nèi)膜崩解的關(guān)鍵因素之一。本研究不但有助于理解月經(jīng)復(fù)雜的生理機(jī)制，而且有助于臨床異常出血的治療。另外，抗氧化劑可能有干擾正常月經(jīng)周期的潛在副反應(yīng)，應(yīng)該值得注意。

［1］Halliwell B，Gutteridge J M，Cross C E.Free radicals，antioxidants，and human disease：where are we now？［J］.J Lab Clin Med，1992，119（6）：598-620.

［2］Behrman H R，Kodaman P H，Preston S L，et al.Oxidative stress and the ovary ［J］.J Soc Gynecol Invest，2001，8（S）：S40-S42.

［3］Sabatini L，Wilson C，Lower A，et al.Superoxide dismutase activity in human follicular fluid after controlled ovarian hyperstimulation in women undergoinginvitrofertilization［J］.Fertil Steril，1999，72（6）：1027-1034.

［4］Ishikawa M.Oxygen radicals-superoxide dismutase system and reproduction medicine ［J］.Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi，1993，45（8）：842-848.

［5］Sugino N，Shimamura K，Takiguchi S，et al.Changes in activity of superoxide dismutase in the human endometrium throughout the menstrual cycle and in early pregnancy［J］.Hum Reprod，1996，11（5）：1073-1078.

［6］Bryan N，Ahswin H，Smart N，et al.Reactive oxygen species ROSa family of fate deciding molecules pivotal in constructive inflammation and wound healing ［J］.Eur Cell Mater，2012，24：249-265.

［7］Evans J，Salamonsen L A.Inflammation，leukocytes and menstruation［J］.Rev Endocr Metab Disord，2012，13（4）：277-288.

［8］Finn C A，Pope M.Vascular and cellular changes in the decidualized endometrium of the ovariectomized mouse following cessation of hormone treatment：apossible model for menstruation［J］.J Endocrinol，1984，100（3）：295-300.

［9］Brasted M，White C A，Kennedy T G，et al.Mimicking the events of menstruation in the murine uterus［J］.Biol Reprod，2003，69（4）：1273-1280.

［10］Xu X B，He B，Wang J D.Menstrual-like changes in mice are provoked through the pharmacologic withdrawal of progesterone using mifepristone following induction of decidualization［J］.Hum Reprod，2007，22（12）：3184-3191.

［11］Agarwal A，Gupta S，Sharma R K.Role of oxidative stress in female reproduction［J］.Reprod Biol Endocrinol，2005，3：28.

［12］Nagy I Z.On the true role of oxygen free radicals in the living state，aging，and degenerative disorders［J］.Ann N Y Acad Sci，2001，928：187-199.

［13］Shkolnik K，Tadmor A，Ben-Dor S，et al.Reactive oxygen species are indispensable in ovulation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（4）：1462-1467.

［14］Kato H，Sugino N，Takiguchi S，et al.Roles of reactive oxygen species in the regulation of luteal function ［J］.Rev Reprod，1997，2（2）：81-83.