孔雀石綠及其代謝物在鯽親子代間傳遞的研究

柯江波，胡 鯤，曹海鵬，楊先樂

（上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫，上海201306）

孔雀石綠（malachite green，MG）于1933年被發(fā)現(xiàn)對魚卵中霉菌、魚體寄生蟲具有良好的殺滅效果，開始廣泛被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖［1］。然而，從20世紀(jì)90年代開始，國內(nèi)外大量的研究發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠降解時間長，及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠（lecuomalachite green，LMG）在魚體內(nèi)和環(huán)境中殘留時間長［2-3］，其化學(xué)官能團(tuán)“三苯甲烷”被確證具有高毒、高殘留、“三致”等毒副作用［4］，因此，歐美等國家陸續(xù)禁止孔雀石綠應(yīng)用于漁業(yè)中，我國也于2002年在水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁止使用孔雀石綠。2006年，英國首先在鮭中檢測出孔雀石綠殘留，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全敲響了警鐘。同年，中國的“多寶魚事件”使得孔雀石綠殘留受到廣泛關(guān)注。我國市售水產(chǎn)品中孔雀石綠檢出率高已是不爭的事實(shí)，自2006年以來，我國陸續(xù)報(bào)道水產(chǎn)品MG殘留的調(diào)查，包括廣東、浙江、湖北和福建等地區(qū)，采用高效液相色譜法或者質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，各地孔雀石綠殘留的檢出率有較大差異，除了廣東湛江出口水產(chǎn)品未檢出MG外，其余各地均有抽檢樣品檢測出孔雀石綠殘留。進(jìn)一步對批發(fā)市場的養(yǎng)殖水以及餐廳暫養(yǎng)用水進(jìn)行采樣檢測，未發(fā)現(xiàn)有孔雀石綠殘留，從而很大程度上排除了運(yùn)輸、貯存等環(huán)節(jié)用藥的可能性，推測市售水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的來源主要是養(yǎng)殖環(huán)節(jié)［5］。

迄今為止，國內(nèi)外對孔雀石綠的研究主要集中在代謝機(jī)制以及殘留檢測方法等。對于孔雀石綠在魚類組織中的殘留是否會隨著繁殖而傳遞尚無研究。孫言春等［6］建立了生殖組織（精巢／卵巢）中孔雀石綠殘留的檢測方法，并檢測證明多年前使用孔雀石綠的池塘再養(yǎng)殖種魚，可在精巢／卵巢檢測到MG和LMG，然而并未進(jìn)一步驗(yàn)證生殖組織中的孔雀石綠殘留是否會傳遞到子代中?？兹甘G禁用前曾被廣泛應(yīng)用于魚卵中水霉病的防治，對魚卵中藥浴孔雀石綠后的殘留消除已有研究［7］。然而親魚階段用藥與魚卵浸泡用藥兩種條件下受精卵及其魚苗中殘留消除情況是否存在差異，尚沒有報(bào)道，有待對比驗(yàn)證。本試驗(yàn)觀察這兩種污染條件下，魚類子代中孔雀石綠的殘留消除規(guī)律，以期為水產(chǎn)品中孔雀石綠溯源分析提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚 健康且大小相近的鯽親魚（Carassius auratus）900條，購于湖北省仙桃市沙湖水產(chǎn)技術(shù)推廣站，體重358g±10g，已完成人工飼料馴化。選擇健康無病害的個體，雌魚要求含卵率高。雌雄分開，各400條于水泥池（4m×4m）中暫養(yǎng)，24h增氧，每天換水1／3。飼養(yǎng)水溫15℃～21℃，每日投餌2次（6：00，18：00），飼料采用空白配合飼料，投喂率為體重的2%～5%，視攝食狀況調(diào)整，定期撈除殘餌。暫養(yǎng)14d后正式試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 孔雀石綠（MG）標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥99.9%）和無色孔雀石綠（LMG）標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥99.6%），Sigma公司產(chǎn)品；浸泡用孔雀石綠（純度≥90%），上海生工試劑有限公司產(chǎn)品，于浸泡前30min用無菌水配制濃度為5mg／mL的溶液，備用。酸性氧化鋁（粒度0.071mm～0.150mm）；乙腈、二氯甲烷、冰乙酸均為色譜純，水為超純水；Agilent-1100型高效液相色譜儀（四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、熒光檢測器）、漩渦混合器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、精密電子天平（METTLER AB104-N）、高速冷凍離心機(jī)和SUPELCO 12管固相萃取裝置，北京成萌偉業(yè)科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 親魚階段 暫養(yǎng)結(jié)束后，停食1d，從雌雄親魚養(yǎng)殖塘中各隨機(jī)選取10條魚，作為空白對照。再從暫養(yǎng)網(wǎng)箱中分別隨機(jī)撈取雌雄鯽各150條，于0.5mg／L的孔雀石綠溶液中浸泡4h，清水洗凈后，分別放入2個水泥池中飼養(yǎng)，記為藥浴組1（雌），藥浴組2（雄），撈取同樣數(shù)量的雌雄親魚分開放入另外2個水泥池中飼養(yǎng)，記為空白組1（雌），空白組2（雄）；飼養(yǎng)條件與暫養(yǎng)相同，另配合投喂新鮮蔬菜。為保持水質(zhì)良好，定時加入少量新水，為親魚的性腺發(fā)育創(chuàng)造良好的水環(huán)境。人工催產(chǎn)前30d左右，精飼料投喂量應(yīng)減少，青飼料量則應(yīng)增加，并逐步增加沖水次數(shù)和沖水量，以加速親魚性腺發(fā)育。于藥浴后 0、0.5、1、2、4、6、12、24、48、72、120、240、480、720h（30d）各個時間點(diǎn)從藥浴組1（雌），藥浴組2（雄）中分別隨機(jī)取8尾魚，取肌肉組織、肝臟組織、精／卵巢組織，每4尾魚的同一組織絞碎并均勻混合后作為一個分析樣品，每個樣品上機(jī)測定2次。

1.2.2 人工繁殖 藥浴試驗(yàn)進(jìn)行至第30天，將藥浴組1、2的親魚與空白組1、2的親魚進(jìn)行交叉繁殖。A組：空白雌魚＋空白雄魚，B組：空白雌魚＋藥浴雄魚，C組：藥浴雌魚＋空白雄魚，D組：藥浴雌魚＋藥浴雄魚。經(jīng)藥物催產(chǎn)，人工受精，收集各組受精卵。

1.2.3 受精卵及魚苗階段 取A組部分空白受精卵（約80g），于0.15mg／L孔雀石綠溶液中浸泡1h，清水沖洗后放于網(wǎng)片上孵化，標(biāo)記為E組。于受精后第0（人工受精當(dāng)天）、1、2、3、4、5、6、7、8、16、32天各個時間點(diǎn)取受精卵或魚苗樣品，每個樣品約4g，測定2次。另外，從各組中隨機(jī)選取100枚受精卵（剔除未受精卵），觀察5組受精卵的出膜時間、胚胎死亡率。

1.2.4 樣品預(yù)處理

1.2.4.1 魚類肌肉及內(nèi)臟樣品預(yù)處理 參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法》［8］，對魚類肌肉及內(nèi)臟團(tuán)進(jìn)行預(yù)處理，上機(jī)檢測。

1.2.4.2 魚類精巢、卵巢及受精卵預(yù)處理 參照孫言春等［13］對受精卵和卵巢以及精巢樣品進(jìn)行預(yù)處理。于40℃旋轉(zhuǎn)蒸干后，加入50μL 0.2mol／L硼氫化鉀溶液，用3mL乙腈溶解殘?jiān)?，充分溶?0s，加入5mL正己烷，渦旋處理30s，4 000r／min離心8min，取下層清液，過0.45μm有機(jī)相濾膜后，上機(jī)檢測。

1.2.5 色譜條件 激發(fā)波長265nm；發(fā)射波長360nm；流動相，即乙腈∶乙酸銨（pH 4.5）＝80∶20（V∶V）；流速1.5mL／min；進(jìn)樣量20μL；柱溫40℃。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 樣品前處理中，孔雀石綠經(jīng)硼氫化鉀還原后轉(zhuǎn)化為無色孔雀石綠，通過熒光檢測器檢測出的濃度為樣品中無色孔雀石綠與孔雀石綠的總濃度，采用 Microsoft Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，并制表和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍以及最低檢測限

肌肉、內(nèi)臟團(tuán)、生殖組織等空白組織中添加孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液，濃度梯度為1、10、50、100、200、500、1 000、2 500μg／kg，按照1.2.4進(jìn)行前處理，根據(jù)1.2.5的色譜條件檢測，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，LMG的濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系和最低檢測限見表1。結(jié)果表明孔雀石綠在1 μg／kg～2 500μg／kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，適用于定量分析，以引起3倍基線噪音的藥量為最低檢測限，本方法中各組織的最低檢測限為1、1、2、2μg／kg。組織中添加適量的孔雀石綠濃度呈3個不同濃度梯度10、50、100μg／kg，經(jīng)前處理并測定得出肌肉、內(nèi)臟團(tuán)、精巢和卵巢中藥品回收率分別為82.64%～95.38%、86.18%～97.94%、77.2%～97.62%、81.92%～98.85%。各組織日內(nèi)（n＝4）相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）在1.56% ～7.48%之間，日間（n＝4）相對標(biāo)準(zhǔn)差在3.54%～8.64%之間。該檢測方法可靠，重復(fù)性良好，準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析要求。

表1 不同樣品中孔雀石綠的線性參數(shù)及檢測限Table 1 Linear relation and deteetion limit of MG in different samples

2.2 孔雀石綠在親魚體內(nèi)的殘留

親魚在0.5mg／L的孔雀石綠藥浴1h后，肌肉與內(nèi)臟組織中在藥浴結(jié)束后檢測到有較多的殘留，隨時間的推移逐漸減少；生殖組織中初始?xì)埩魸舛容^低，出現(xiàn)先上升，達(dá)到平衡后緩慢下降的趨勢。雌雄親魚各組織中孔雀石綠殘留濃度變化規(guī)律無顯著差異。

由圖1可知，親魚浸泡孔雀石綠后0h時，精巢、卵巢中均未檢測到孔雀石綠及其無色孔雀石綠的殘留，0.25h開始檢測到MG，之后濃度逐漸增加，均在第4天達(dá)到峰值，雌雄親魚分別為63.4μg／kg±1.3μg／kg和43.6μg／kg±1.2μg／kg，可能原因是孔雀石綠進(jìn)入魚體內(nèi)主要通過皮膚吸收，口、鰓的吸入作用，所以藥浴后在肌肉和內(nèi)臟中產(chǎn)生較多的殘留，而經(jīng)過一段時間的代謝，魚體內(nèi)的MG殘留部分轉(zhuǎn)移到其他組織中，部分在生殖組織中產(chǎn)生蓄積。同一時間點(diǎn)的殘留濃度大?。簝?nèi)臟團(tuán)＞肌肉＞生殖組織，內(nèi)臟中的殘留主要通過鰓的呼吸和攝取水中懸浮顆粒物，因此其在內(nèi)臟中濃度最高，肌肉中的殘留主要來源于水中，濃度次之?？兹甘G在魚體內(nèi)的代謝較慢，在第768小時（32d），卵巢中MG濃度為33.5μg／kg±0.3μg／kg，精巢中 MG 濃度為15.4μg／kg±1.2μg／kg。研究表明，無色孔雀石綠具有很強(qiáng)的親脂性，在脂肪含量較多的組織殘留時間更長［9］。魚類脂肪呈不均勻分布，主要存在于皮下和臟器周圍，肌肉組織中含量甚少，魚卵和精巢含有豐富的脂肪［10］。因此，精巢、卵巢中 MG的消除速率相對于肌肉及內(nèi)臟較慢（圖1）。

2.3 不同處理?xiàng)l件下鯽子代體內(nèi)的孔雀石綠殘留

結(jié)果顯示，親魚體內(nèi)殘留的孔雀石綠會通過繁殖行為在子代中產(chǎn)生殘留，與空白受精卵浸泡孔雀石綠產(chǎn)生的殘留濃度相比，前者的殘留濃度較低。如表2所示，在第1天除A組未檢測到MG外，親魚污染傳遞組B、C、D，均在受精卵中檢測出，分別為5.1、23.8、29.5μg／kg。試驗(yàn)結(jié)果證明了孔雀石綠殘留可以在魚類親子代間傳遞。B組在第5天檢測不到藥物殘留，C組、D組在第32天仍有少量殘留。E組受精卵浸泡孔雀石綠，初始?xì)埩魸舛容^高，為1 265.8μg／kg，而在魚苗完全孵出后（第5天）的取樣檢測，魚苗中殘留量為163.4μg／kg。

圖1 雌雄親魚肌肉、內(nèi)臟、精／卵巢中孔雀石綠的濃度變化Fig.1 Concentration changes trend of MG in muscle，viscera，sperm／ovary of parent fish

在胚胎發(fā)育過程中，卵凝結(jié)一般導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止，胚胎趨于死亡或者死亡。在72h時，有些胚胎孵化不出來，發(fā)生卵凝結(jié)，也作為死亡一起統(tǒng)計(jì)。對不同時間內(nèi)鯽胚胎死亡數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖2。胚胎在孵化48h后就出現(xiàn)卵凝結(jié)現(xiàn)象，且A、B組卵凝結(jié)率較C、D、E組明顯。同一組別胚胎卵凝結(jié)率。隨時間的增加而增加。

如圖3，殘留有孔雀石綠的胚胎出膜要比A組無污染胚胎出膜延遲。A組胚胎在72h完全出膜，B、C組在96h完全出膜，而D組胚胎延遲到96h。受精卵浸泡使用孔雀石綠，其出膜時間要長于親魚體內(nèi)胚胎染毒的時間。

表2 鯽受精卵以及魚苗中孔雀石綠濃度變化Table 2 Concentration changes of MG in fertilized eggs and fry of crucian carp

圖2 受精卵的死亡率Fig.2 The mortality of embryos

圖3 受精卵的出膜時間Fig.3 The hatching time of embryos

3 討論

受孔雀石綠污染的雌雄親魚分別與空白雌雄親魚交叉繁殖，人工授精產(chǎn)出的受精卵中藥物殘留濃度存在差異，這可能與繁殖行為中雌雄配子貢獻(xiàn)的物質(zhì)比例不同有關(guān)。與精子相比，卵子提供較多的物質(zhì)，從而導(dǎo)致受污染卵子形成的受精卵中孔雀石綠殘留濃度較大。

無污染的受精卵浸泡0.15mg／L的孔雀石綠溶液1h，在受精卵中檢測出大量的MG殘留，在其出膜前，受精卵中MG殘留保持在一個較高的水平。第5天完全出膜后，魚苗中孔雀石綠的濃度大幅度下降?？赡艿脑蚴撬幵∵^程中，水中的孔雀石綠主要在受精卵表面吸附，受精卵個體小，比表面積大，因此吸附了大量的MG。同時，部分MG經(jīng)滲透作用進(jìn)入受精卵中，在孵化過程中，卵膜上的藥物殘留不斷釋放到水體中，同時卵膜能阻隔大部分的孔雀石綠。大量的孔雀石綠未能進(jìn)入受精卵的胚胎內(nèi)，有效保護(hù)了胚胎的發(fā)育。張明輝等［7］的研究以10.0mg／L濃度的孔雀石綠處理異育銀鯽、團(tuán)頭魴受精卵10min，結(jié)果顯示，初始濃度分別為20 886.73、25 569.30μg／kg，在出苗第10天的藥物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于浸泡后初始濃度，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

鯉、鯽等產(chǎn)黏性卵，在孵化階段易感染水霉，導(dǎo)致孵化率低。而孔雀石綠的使用能在此階段有效地防治水霉，親脂性無色孔雀石綠入侵細(xì)胞能力較強(qiáng)，抑菌效果明顯［11］。研究證明，孔雀石綠不僅可以有效地控制卵菌綱真菌在魚卵和魚體上的生長繁殖，同時可預(yù)防和治療二次感染［12］。

本試驗(yàn)條件下，受精卵的死亡率主要來源于水霉菌感染，受精卵從親魚獲得的MG殘留，對水霉起到一定的抑制作用，受精卵中MG濃度越高，死亡率越低，空白受精卵約有90%死亡率。經(jīng)藥浴的受精卵未發(fā)現(xiàn)有水霉感染，說明吸附在受精卵表面的孔雀石綠起到很好的抑制水霉作用。受精卵中孔雀石綠的含量與其出膜時間呈現(xiàn)一定的反比例關(guān)系。Meyer F P等［13］發(fā)現(xiàn)，虹蹲魚卵在高劑量的孔雀石綠溶液（0.20μg／L）中長時間暴露后，胚胎的存活率下降，孵化時間延長，孵化出的魚苗出現(xiàn)脊椎、頭、背鰭等部位的畸變。

由于孔雀石綠的高效以及價格低廉，部分育苗場仍在偷偷使用孔雀石綠用于防治水霉病。在水產(chǎn)執(zhí)法過程中，部分養(yǎng)殖戶以購買的親魚殘留MG導(dǎo)致魚卵中檢測出為由，否認(rèn)使用孔雀石綠浸泡魚卵。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，孔雀石綠從親代傳遞到子代，魚卵中的殘留初始濃度一般較低。通過浸泡孔雀石綠的魚卵，其初始?xì)埩魸舛葎t較高，在出苗前一直保持較高的水平，且在出苗后，魚苗中孔雀石綠的濃度相比于魚卵，有大幅度的下降。了解這兩種不同來源的污染導(dǎo)致魚類子代中MG殘留濃度存在差異，可為魚卵階段的藥物殘留溯源分析提供判別方法。執(zhí)法部門在對育苗場進(jìn)行抽查時，抽檢魚卵并進(jìn)行一定時間的跟蹤檢測，以明確用藥途徑，追究相關(guān)責(zé)任人，從而在源頭上杜絕孔雀石綠的使用。

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