慢性乙型肝炎患者呼出氣體的電噴霧萃取電離質(zhì)譜分析

王海東等

摘 要 應(yīng)用電噴霧萃取電離質(zhì)譜法對慢性乙型肝炎患者（41例）及正常人（34例）的呼出氣體樣本進(jìn)行檢測，迅速獲得其一級質(zhì)譜指紋譜圖，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法主成分分析（PCA）和聚類分析（CA）對所獲得的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，可有效區(qū)分患者與正常人群，且不同臨床類型慢性乙肝聚類分析圖譜有不同表現(xiàn)，此結(jié)果有助于慢性乙型肝炎的臨床診斷和病情分析。另外，本方法也為發(fā)展簡單、快速、非侵入性慢性乙型肝炎臨床診斷方法提供解決思路。

關(guān)鍵詞 慢性乙型肝炎； 呼出氣體； 電噴霧萃取電離質(zhì)譜； 主成分分析； 聚類分析

1 引 言

肝臟是人體內(nèi)最大的消化腺，也是體內(nèi)解毒和新陳代謝的中心。肝臟疾病有著高發(fā)病率和死亡率，病因復(fù)雜多樣，臨床可表現(xiàn)從無癥狀至嚴(yán)重的肝功能衰竭[1]。臨床醫(yī)師很早就發(fā)現(xiàn)，肝昏迷的患者呼出氣中就有一種肝臭氣味。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是分析化學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，呼出氣體檢測作為一種了解人體生理代謝過程和疾病狀況的方法備受關(guān)注[2，3]。呼出氣與常規(guī)的血液檢測方法相比，檢測的最大優(yōu)點(diǎn)是采樣簡單，具有非侵入性，且樣本連續(xù)可得[4]。目前，對呼出氣研究多集中在肺部疾病和環(huán)境氣體，肝病的呼出氣研究鮮有報道。

常規(guī)的呼出氣檢測質(zhì)譜方法為氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）法，而此方法需經(jīng)過復(fù)雜的前處理及色譜分離過程，難以滿足臨床診斷的快速分析。電噴霧萃取電離質(zhì)譜（EESIMS）是一種新型的直接質(zhì)譜分析方法，可在無需樣品預(yù)處理?xiàng)l件下對復(fù)雜基體樣品進(jìn)行直接、快速、靈敏、高通量質(zhì)譜檢測[5，6]。與其它質(zhì)譜技術(shù)相比較，EESIMS可直接檢測患者呼出氣體，且靈敏度高、響應(yīng)速度快，能夠?qū)崿F(xiàn)呼出氣體中的痕量有機(jī)物的原位、實(shí)時、在線的分析[6＼] 。

本研究利用電噴霧萃取電離質(zhì)譜（EESIMS）技術(shù)對41例慢性乙型肝炎患者呼出氣進(jìn)行了初步分析，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對所獲得的指紋圖譜對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表明，EESIMS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)算法僅依靠一級譜圖即可對慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出氣體樣本進(jìn)行較好區(qū)分，故而對疾病的診斷和病情的判斷均有一定的臨床意義。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

EESI 離子源[7，8]（東華理工大學(xué)研制）；LTQXL 增強(qiáng)型線性離子阱質(zhì)譜儀（美國Finnigan 公司），配有Xcalibur 數(shù)據(jù)系統(tǒng)；T2PV/L 型 5L Tedlar采樣袋（大連德霖氣體包裝有限公司）；甲醇（色譜純，SK Chemicals 公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

Tedlar采樣袋在使用前用氮?dú)馇逑?次，每次30 min， 烘干以除去可能殘留的吸附物。受試者夜間禁食、禁煙、禁酒，晨起后勿刷牙，在通風(fēng)條件良好的環(huán)境下呼吸30 min以上，在安靜狀態(tài)下向5LTedlar采樣袋內(nèi)呼氣，直至氣袋充滿為止，同時收集周圍空氣作為實(shí)驗(yàn)背景空白。呼氣樣本收集完畢后利用EESIMS在3 h內(nèi)完成所有樣本的檢測分析。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件

EESIMS分析條件：EESI離子源角度（α，β）和距離（a，b）根據(jù)以往文獻(xiàn)＼[7，8＼]優(yōu)化調(diào)節(jié)，質(zhì)譜采用正離子檢測模式，霧化氣（N2）壓力為1.2 MPa；進(jìn)樣口溫度為100℃，掃描質(zhì)量范圍50～800 Da；噴霧電壓為3. 5 kV；萃取劑甲醇溶液流速為5 μL/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 41例慢性乙型肝炎患者與正常人呼出氣體的質(zhì)譜分析

采用正離子掃描模式，在優(yōu)化的EESIMS條件下對肝病患者和健康對照組呼出氣體樣本進(jìn)行快速質(zhì)譜分析，可以得到其一級質(zhì)譜指紋譜圖（圖1）。從圖1可知，41例患者同對照組呼出氣體樣本在m/z 50～400范圍內(nèi)具有豐富的物質(zhì)信息，表明EESIMS能夠同時檢測到呼出氣體中的多種組分。雖然質(zhì)譜圖在m/z>400處的質(zhì)譜信號相對較低，但將指紋圖譜放大20倍后仍可獲得信噪比較高（S/N>10）的質(zhì)譜。由于呼出氣體中的揮發(fā)性標(biāo)志物含量都較低，所以在一級質(zhì)譜圖中患者與正常人的主要質(zhì)譜峰基本相同。但是，仔細(xì)觀測這些質(zhì)譜峰信號后可以發(fā)現(xiàn)仍然差別，主要體現(xiàn)在m/z 56， 74， 89， 105， 157， 201， 279， 318等質(zhì)譜信號。為了更好地區(qū)分患者與正常人的呼出氣體的差異，本研究采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對質(zhì)譜信號進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

3.3 慢性乙肝不同臨床類型患者的聚類分析

聚類分析（CA）是一種靜態(tài)數(shù)據(jù)分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，它能夠?qū)⒆蛹g更細(xì)微的區(qū)別與聯(lián)系以譜系圖的方式直觀地表現(xiàn)出來，目前已廣泛應(yīng)用于模式識別和圖像分析等領(lǐng)域[17]。本實(shí)驗(yàn)將已進(jìn)行過PCA分析的慢性乙型肝炎患者與正常人呼出氣體樣本一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab軟件自帶的聚類分析程序中進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖4所示。慢性乙肝患者呼出氣體樣本為41個，正常人呼出氣體樣本為34個，從分析結(jié)果可知，1～102號樣本點(diǎn)（正常人的呼出氣體）經(jīng)軟件程序分析后自聚成一類，103～225號樣本點(diǎn)（慢性乙型肝炎患者的呼出氣體）自聚成另一類，從而說明聚類分析能夠明顯的對慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出氣體樣本進(jìn)行區(qū)分，這與PCA 的分析結(jié)果相印證。而在慢性乙型肝炎患者呼出氣體樣本中，又可明顯看到其一大類中又自聚成4個亞類，分析其可能原因?yàn)椋?03～171號樣本點(diǎn)的23例患者為慢性重型或重度肝炎，病情重，病情進(jìn)展較快，并發(fā)癥較多，短期內(nèi)發(fā)展成為肝衰竭；172～189號樣本點(diǎn)的6例患者診斷為肝硬化，病程長至數(shù)月，患者就診時多已出現(xiàn)腹水，處于肝硬化失代償期；190～204號的5例患者來說起病較緩，病情相對較輕，結(jié)合生化檢查診斷為慢性中度乙型病毒性肝炎；205～225號的7例患者為慢性輕度乙型病毒性肝炎，臨床表現(xiàn)為食欲下降，睡眠不佳等，癥狀不明顯，生化檢查僅1～2項(xiàng)輕度異常；從慢性乙型肝炎的不同類型之間，因?yàn)楦闻K的損傷程度不同，而對所測到的物質(zhì)的代謝也有區(qū)別，表現(xiàn)形式不同，符合慢性乙型肝炎的病理生理過程。因此可能成為它們自聚成一類的原因；而本實(shí)驗(yàn)在PCA分析中未發(fā)現(xiàn)此差異，說明CA分析能夠直觀地表現(xiàn)出子集之間更細(xì)微的差別與聯(lián)系。

4 結(jié) 論

綜上所述，利用EESIMS對慢性乙型肝炎患者及正常人呼出氣體樣本進(jìn)行直接質(zhì)譜分析，獲得其一級質(zhì)譜指紋譜圖，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)中主成分分析法（PCA）和聚類分析法（CA）對所獲得的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，僅一級譜圖即可將慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出氣體樣本快速、靈敏、準(zhǔn)確地區(qū)分開來，且對于臨床不同類型慢性乙型肝炎輕和重也有區(qū)別。這個結(jié)果對于慢性乙型肝炎的臨床診斷和病情分析有一定的幫助，此方法也為簡單、快速、非侵入性臨床診斷方法的開發(fā)提供一種思路。但本研究樣本量較少，部分區(qū)別的物質(zhì)還未能確定，還需進(jìn)一步深入的研究。

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