硅膠固相萃取—高效液相色譜法檢測(cè)油炸肉制品中的丙烯酰胺

鄭衛(wèi) 徐世明 趙瑞連 張建梅 郭光平 孫承鋒 王光杰

摘 要：實(shí)驗(yàn)建立一種利用硅膠固相萃取-高效液相色譜來(lái)檢測(cè)油炸肉制品中丙烯酰胺的含量的方法。采用硅膠作為萃取材料對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，利用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm，流動(dòng)相為甲醇-水（5∶95，V/V），流速為0.8 mL/min。方法加標(biāo)回收率為73.5%～80.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.54%，最低檢出限為10 ng/mL。該方法簡(jiǎn)便、可靠，滿足油炸肉制品中丙烯酰胺的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：油炸肉制；硅膠；固相萃??；高效液相色譜

Detection of Acrylamide in Fried Meat Products by Silica Gel Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

ZHENG Wei1， XU Shiming2，*， ZHAO Ruilian2， ZHANG Jianmei2， GUO Guangping2， SUN Chengfeng1，

WANG Guangjie2

（1.Institute of Food Science and Engineering， Yantai University， Yantai 264005， China；

2.Yantai Xiwang Food Co. Ltd.， Yantai 264002， China）

Abstract： This paper presents a silica gel solid phase extraction-high performance liquid chromatography （HPLC） method to detect the content of acrylamide in fried meat products. The extract was cleaned up by solid phase extraction using silica gel as the adsorbent prior to being analyzed by HPLC. The detection wavelength was set at 205 nm. The separation was performed using a Kromisil C18 （250 mm × 4.6 mm， 5 ?m）. The mobile phase used was a 5：95 （V/V）mixture of methanol and water at a flow rate of 0.8 mL/min. Recoveries of the proposed method for spiked samples ranged from 73.5% to 80.8%， with relative standard deviation （RSD） no greater than 5.54% （n = 5）. The limit of detection was 10 μg/mL （S/N = 3）. This method is simple and reliable， and can be used for the detection of acrylamide in fried meat products.

Key words： fried meat products； silica gel； solid phase extraction； high performance liquid chromatography （HPLC）

中圖分類號(hào)：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001

丙烯酰胺是一種極性小分子物質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為71.08，易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮[1]，微溶于乙酸乙酯，不溶于苯基庚烷[2]。2002年瑞典科學(xué)家首次在食品中發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺[3]，由于丙烯酰胺對(duì)人體有潛在致癌性[4-6]、神經(jīng)毒性[7-9]、生殖毒性[9-10]等多重毒性[11]，而引起了各國(guó)科研人員的關(guān)注，進(jìn)而掀起了研究丙烯酰胺的熱潮。目前關(guān)于丙烯酰胺的研究大多集中于薯類[13-14]及淀粉類食品[15-17]，肉類制品的研究較少。由于肉制品由于富含蛋白質(zhì)，也含有氨基酸和糖類物質(zhì)，在高溫加工過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)而產(chǎn)生丙烯酰胺[18]，因此油炸肉制品中丙烯酰胺含量的研究具有實(shí)際意義。章宇等[19]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了兩組油炸雞翅中丙烯酰胺的含量，結(jié)果分別為146.6 μg/kg和213.5 μg/kg，陳旭明等[20]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)了炸雞腿及炸雞骨中丙烯酰胺的含量，檢測(cè)結(jié)果分別為365 μg/kg和703 μg/kg。

目前丙烯酰胺的主要檢測(cè)方法是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[21-22]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[23-24]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用需要衍生，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用費(fèi)用昂貴，不利于推廣[25]。實(shí)驗(yàn)以油炸肉制品為研究對(duì)象，建立了一種硅膠固相萃取-高效液相色譜檢測(cè)油炸肉制品中丙烯酰胺的方法，該方法簡(jiǎn)便、可靠，滿足油炸肉制品中丙烯酰胺的檢測(cè)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油炸肉制品購(gòu)自學(xué)校周邊市場(chǎng)。

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（≥99.9%） 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；甲醇（液相色譜級(jí)） 德國(guó)默克股份公司；硅膠（分析純） 青島邦凱分離材料有限公司；針式過(guò)濾頭（0.22 ?m，有機(jī)相） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；超純水自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1100高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；分析天平 德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；WH-3微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；TG16-WS離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；粉碎機(jī) 青島漢尚電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取適量粉碎均勻的樣品于錐形瓶中，加入40 mL正己烷振蕩10 min以除去脂肪，棄去正己烷，并揮發(fā)干殘余的正己烷，加入40 mL甲醇溶液，振蕩提取30 min，重復(fù)提取2 次，合并提取液，6 000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移入平底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入30 mL乙酸乙酯提取，重復(fù)2 次，合并乙酸乙酯溶液于錐形瓶中，加入3.0 g硅膠，50 ℃條件下萃取1.0 h，蒸干乙酸乙酯，得到萃取后的硅膠，用60 mL甲醇分3 次對(duì)所得到的硅膠進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，定容至5 mL，高效液相色譜檢測(cè)前用0.22 ?m有機(jī)相濾膜過(guò)濾。

1.3.2 高效液相色譜檢測(cè)條件

色譜柱：Kromisil C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：甲醇-水（5∶95，V/V）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 ?L；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm。依據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性，峰面積進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件的確立

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用紫外分光光度計(jì)對(duì)5.0 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在190～300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，根據(jù)得到的連續(xù)吸光度變化圖，得知丙烯酰胺在205 nm附近有最大吸收值，由于高效液相色譜儀上的紫外檢測(cè)器與紫外分光光度計(jì)存在差異，因此再利用高效液相色譜對(duì)丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液205 nm和210 nm進(jìn)行檢測(cè)，由圖1可知，205 nm處峰面積明顯比210 nm要大，因此選擇205 nm作為丙烯酰胺的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

分別用超純水、甲醇-水（3∶97，V/V））、甲醇-水（5∶95，V/V）作流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，觀察峰型及保留時(shí)間，超純水作流動(dòng)相時(shí)峰寬較大，此外純水作流動(dòng)相對(duì)C18色譜柱會(huì)產(chǎn)生不良影響；甲醇-水（3∶97，V/V）時(shí)，峰型尚好，但是對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，試樣中的丙烯酰胺未能分離出來(lái)；甲醇-水（5∶95，V/V）時(shí)，峰型良好，也能將試樣中的丙烯酰胺分開(kāi)，因此選擇流動(dòng)相為甲醇-水（5∶95，V/V）。

2.1.3 流速的選擇

通過(guò)設(shè)置流速0.5、0.8、1.0 mL/min比較3 種流速對(duì)丙烯酰胺保留時(shí)間、峰型的影響，由圖2可知，流速對(duì)保留時(shí)間、峰型有影響，流速增大，保留時(shí)間減小；流速降低，保留時(shí)間變大，峰寬增大。0.5 mL/min時(shí)，峰寬較大，保留時(shí)間較大，而1.0 mL/min時(shí)，保留時(shí)間偏小，因此流速選擇0.8 mL/min。

2.2 樣品預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)水、甲醇、乙醇3 種提取溶劑進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，乙醇在丙烯酰胺保留時(shí)間處有峰出現(xiàn)，因此排除乙醇，水及甲醇均對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，考慮到用甲醇提取后更利于濃縮，故選取甲醇提取溶劑。然后采用固相萃取法對(duì)提取液進(jìn)行凈化，實(shí)驗(yàn)比較了活性炭、C18和硅膠3種固相材料的萃取效果，結(jié)果表明硅膠的萃取和凈化效果最好，因此實(shí)驗(yàn)選擇硅膠作為凈化材料。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取適量丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)使用溶液配制成質(zhì)量濃度分別為5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，過(guò)膜后進(jìn)行檢測(cè)，丙烯酰胺保留時(shí)間為6.02 min。以各質(zhì)量濃度丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)所得峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=232.48x-3.014 6，R2=0.999 6。曲線方程顯示丙烯酰胺質(zhì)量濃度在0.1～5.0 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，

2.4 精密度、回收率與檢出限

選擇0.1、1.0、5.0 ?g/mL這3 個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5 次，計(jì)算得到3 個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表1所示。分別取含有3、5、7 ?g的丙烯酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照樣品提取方法進(jìn)行提取、凈化并進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其回收率，結(jié)果如表2所示。

實(shí)驗(yàn)以3 倍信噪比（RS/N）作為基準(zhǔn)，取低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，測(cè)得丙烯酰胺的最低檢測(cè)限為10 ng/mL。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

按照1.3.1節(jié)的前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，然后在1.3.2節(jié)高效液相色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)際樣品的丙烯酰胺含量檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用硅膠固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)油炸肉制品中的丙烯酰胺。利用硅膠作為固相萃取材料對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，較好的去除雜質(zhì)的干擾；通過(guò)對(duì)高效液相色譜檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，使得樣品中丙烯酰胺得到了較好的分離。方法的加標(biāo)回收率為73.5%～80.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.54%，最低檢出限為10 ng/mL，滿足油炸肉制品中丙烯酰胺的檢測(cè)要求。

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