人乳頭狀瘤病毒E6、E7蛋白在維吾爾族及漢族宮頸癌發(fā)展中的表達(dá)及意義

王琳 韓莉莉 瑪依努爾·尼牙孜 隋霜

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，新疆烏魯木齊830001

人乳頭狀瘤病毒E6、E7蛋白在維吾爾族及漢族宮頸癌發(fā)展中的表達(dá)及意義

王琳 韓莉莉 瑪依努爾·尼牙孜▲隋霜

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，新疆烏魯木齊830001

目的分析維吾爾族及漢族宮頸癌患者中人乳頭狀瘤病毒（HPV）E6、E7蛋白表達(dá)與宮頸癌癌前病變惡性進(jìn)展的關(guān)系，進(jìn)一步了解其在維吾爾族及漢族宮頸癌患者間是否存在差異。方法選取2013年4月～2014年4月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科門診行第二代雜交捕技術(shù)HPV DNA檢測結(jié)果為陽性的133例維吾爾族（n= 75）和漢族（n=58）患者宮頸不同病變程度的石蠟包埋宮頸組織。采用免疫組化法分別檢測各組織中HPV E6、E7蛋白表達(dá)，使用Spearman等級相關(guān)分析HPV E6、E7蛋白表達(dá)與病變程度的相關(guān)性，并采用χ2檢測比較維吾爾族及漢族宮頸癌患者HPV E6、E7蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果維吾爾族和漢族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織中HPV E6的陽性率，隨著病情的進(jìn)展呈逐漸增高趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=39.61，P=0.001；χ2= 19.77，P=0.001）；Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，維吾爾族及漢族宮頸癌患者HPV E6蛋白的表達(dá)與宮頸病變級別均呈顯著正相關(guān)（r=0.708，P=0.001；r=0.729，P=0.001）、HPV E7在維吾爾族和漢族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織中的陽性表達(dá)率，隨著病情的進(jìn)展呈逐漸增高，多組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=32.48，P=0.001；χ2= 24.16，P=0.001）；Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，維吾爾族及漢族宮頸癌患者E6蛋白表達(dá)與宮頸病變級別均呈顯著正相關(guān)（r=0.649，P=0.001；r=0.759，P=0.001）；慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3維吾爾族患者HPV E6、E7蛋白的陽性表達(dá)率高于漢族，維吾爾族宮頸癌患者HPV E6、E7蛋白表達(dá)率低于漢族，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論HPV E6、E7蛋白是維吾爾族和漢族宮頸癌發(fā)展的重要因素，HPV E6、E7蛋白可能具有預(yù)測宮頸病變進(jìn)展的價值。

人乳頭狀瘤病毒曰E6蛋白曰E7蛋白曰宮頸癌曰維吾爾族曰漢族

高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)感染是宮頸癌及宮頸病變發(fā)生發(fā)展的必要條件[1]。HPV感染在人群中具有普遍性，并且感染型別也不盡相同[2-3]。HPV致癌的分子機(jī)制主要與其表達(dá)的E6、E7蛋白有關(guān)。HPV早期基因E6和E7不僅可以結(jié)合被感染宿主細(xì)胞的DNA，同時還與細(xì)胞內(nèi)的抑癌基因p53和pRb分別結(jié)合，抑制或降低p53和pRb的抑癌功能，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞發(fā)生[4-6]。新疆在中國的西北邊陲，是宮頸癌高發(fā)地區(qū)之一，并且維吾爾族婦女位居全國少數(shù)民族首位[7]，并且近2/3就診的維吾爾族宮頸癌患者已達(dá)到中晚期[8]，目前維吾爾族婦女宮頸癌高發(fā)的原因尚不清楚。本研究采用免疫組化方法檢測維吾爾族和漢族婦女慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasm，CIN）及宮頸鱗癌組織中的HPV E6、E7蛋白的表達(dá)情況，探討維吾爾族和漢族中HPV E6、E7蛋白表達(dá)與宮頸癌前病變惡性進(jìn)展的關(guān)系，并進(jìn)一步了解其在維吾爾族及漢族宮頸癌患者間是否存在差異，為尋找維吾爾族宮頸癌高發(fā)的原因和發(fā)現(xiàn)能夠預(yù)測CIN轉(zhuǎn)歸的分子標(biāo)志物作一初步探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月～2014年4月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科門診行第二代雜交捕技術(shù)（Hybrid capture 2，HC-Ⅱ）HPV DNA檢測的婦女中，選取高危型HPV陽性且有宮頸組織病理學(xué)診斷、已婚無全子宮切除手術(shù)史、未婚而有性生活史，且調(diào)查前6個月內(nèi)無宮頸及陰道手術(shù)治療史、CIN和宮頸癌病史、自身免疫性疾病或口服免疫抑制劑、急性生殖道炎癥的婦女。納入研究對象133例，包括維吾爾族75例和漢族58例，年齡25～81歲，平均（41.2±2.1）歲。根據(jù)最終組織病理學(xué)，包括漢族慢性宮頸炎11例，CIN 1 13例，CIN 2～3 18例，宮頸鱗癌16例；維吾爾族慢性宮頸炎19例，CIN 1 9例，CIN 2～3 22例，宮頸鱗癌25例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且所有參與實驗者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

采用免疫組化檢測HPV16 E6、E7蛋白表達(dá)，納入研究對象的宮頸組織樣本均做常規(guī)HE染色，由高年資病理醫(yī)生對HE染色切片進(jìn)行組織學(xué)觀察和復(fù)診，并進(jìn)行病理分級，宮頸癌病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科病理學(xué)》。采用Envision法檢測宮頸石蠟包埋組織中HPV 16 E6、E7蛋白的表達(dá)，一抗為鼠抗人HPV16 E6、E7單克隆抗體（SC-460，美國Santa Cruz公司），工作濃度為1∶100，實驗步驟按免疫組化Envision試劑盒（DAKO公司）說明書進(jìn)行。用已知陽性的宮頸癌標(biāo)本作陽性對照，用已知陰性的正常宮頸標(biāo)本作陰性對照，用PBS緩沖液代替一抗作空白對照。

1.3 判讀標(biāo)準(zhǔn)

檢測結(jié)果判定：細(xì)胞核棕黃色為染色陽性，隨機(jī)選取10個視野，400倍鏡下觀察每個視野中20個細(xì)胞，共計200個細(xì)胞，以陽性細(xì)胞數(shù)＞10%判為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman秩相關(guān)檢驗分析HPV E6、E7 DNA蛋白表達(dá)和宮頸病變級別的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維吾爾族及漢族不同病變程度的宮頸組織中HPV E6、E7蛋白的表達(dá)情況及其相關(guān)性分析

隨著病情的進(jìn)展，HPV E6在維吾爾族及漢族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織中的陽性表達(dá)率呈逐漸增高趨勢，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 39.61，P=0.001；χ2=19.77，P=0.001）；Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，維吾爾族及漢族HPV E6蛋白表達(dá)與宮頸病變程度均呈顯著正相關(guān)（r=0.708，P=0.001；r=0.729，P=0.001）。隨著病情的進(jìn)展，HPV E7在維吾爾族及漢族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織中的陽性表達(dá)率呈逐漸增高趨勢，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=32.48，P=0.001；χ2=24.16，P=0.001）；Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，HPV E7蛋白表達(dá)與宮頸病變程度均呈顯著正相關(guān)（r=0.649，P=0.001；r=0.759，P=0.001）。見表1。

2.2 維吾爾族及漢族不同病理級別的宮頸組織中HPV E6、E7蛋白陽性表達(dá)率比較

維吾爾族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3患者宮頸組織中E6蛋白的陽性表達(dá)率高于漢族，維吾爾族宮頸癌患者E6蛋白的陽性表達(dá)率低于漢族，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。維吾爾族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3患者宮頸組織中E7蛋白的陽性表達(dá)率高于漢族，維吾爾族宮頸癌患者E7蛋白的陽性表達(dá)率低于漢族，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

3 討論

眾多研究顯示，高級鱗狀上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中E6和E7蛋白的表達(dá)水平顯著提高，表明E6及E7蛋白的表達(dá)水平與宮頸病變的進(jìn)展程度及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。高危型HPV感染后病毒癌蛋白E6、E7發(fā)揮調(diào)解細(xì)胞凋亡的作用。新疆南部的維吾爾族是宮頸癌的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率及死亡率均高于同一地理環(huán)境的其他少數(shù)民族[9-10]。是否在維吾爾族和漢族宮頸病變惡性進(jìn)展過程中E6、E7蛋白表達(dá)存在差異，目前尚沒有明確報道。故本研究采用免疫組化方法檢測維吾爾族和漢族慢性宮頸炎、CIN、宮頸鱗癌組織中的HPV E6、E7蛋白表達(dá)情況，初步探索維吾爾族宮頸癌高發(fā)的原因。

表1 漢族及維吾爾族不同病變程度的宮頸組織中HPV E6、E7蛋白在的表達(dá)情況[%（n1/n2）]

HPV E6蛋白由150個氨基酸構(gòu)成，在各個型別HPV的E6蛋白具有同源的的氨基酸，其共同特征都存在Cys-x-x-Cys鋅指結(jié)構(gòu)，這種鋅指結(jié)構(gòu)與其功能如惡性轉(zhuǎn)化的作用、轉(zhuǎn)錄激活及細(xì)胞蛋白間相互作用等密切相關(guān)。E6通過E6關(guān)聯(lián)蛋白（E6 associated protein，E6-AP）與P53結(jié)合，降解P53可影響到細(xì)胞內(nèi)的多條信號途徑，從而影響細(xì)胞周期。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPV E6蛋白的表達(dá)在維吾爾族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織的陽性率隨著病情的進(jìn)展呈逐漸增高趨勢，并且HPV E6蛋白表達(dá)與宮頸病變級別具有顯著相關(guān)。在漢族中，也發(fā)現(xiàn)了相同的趨勢。

本研究結(jié)果提示HPV E6蛋白在宮頸病變的早期發(fā)揮作用。在HPV感染的宮頸各個級別病變中，宮頸癌E6蛋白的檢出率接近100%，在慢性宮頸炎組和CIN 1組的蛋白表達(dá)率不足50%，HPV E6蛋白的表達(dá)可能在一定程度上解釋宮頸低度病變?nèi)匀淮蟛糠帜軌蚰孓D(zhuǎn)[11]，而CIN 2～3病變的HPV E6的表達(dá)率達(dá)75%左右，進(jìn)一步發(fā)展成宮頸癌的比例大，提示宮頸病變的病情進(jìn)展或轉(zhuǎn)歸可能與E6蛋白的表達(dá)有關(guān)。李惠新等[12]也使用免疫組化的方法也發(fā)現(xiàn)宮頸高度病變和宮頸癌E6蛋白的表達(dá)率高，與本研究結(jié)果一致。目前液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測聯(lián)合HPV檢查具有較好的篩查效果[13-14]，在此基礎(chǔ)上結(jié)合E6蛋白的表達(dá)可能更有助于判斷HPV感染的預(yù)后[10]。

HPV E7蛋白由100個氨基酸構(gòu)成，含有3個功能區(qū)，具有鋅指結(jié)構(gòu)。其主要功能是能夠與Rb蛋白結(jié)合，使靜止的G0期細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行有絲分裂。與E6協(xié)同作用導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生永生化。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，HPV E7在維吾爾族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織中陽性表達(dá)率隨著病情的進(jìn)展呈逐漸增高趨勢，并且HPV E7蛋白表達(dá)與宮頸病變級別具有顯著相關(guān)。在漢族中，也發(fā)現(xiàn)了相同的趨勢。提示在維吾爾族宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，E7蛋白可能在HPV致癌的早期過程，CIN發(fā)生發(fā)展的早期階段發(fā)揮重要作用。本研究CIN 1的表達(dá)率在25%左右，可見在早期CIN階段E7蛋白已明顯表達(dá)。維吾爾族宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的過程中，HPV E6、E7均發(fā)揮重要作用。

在維吾爾族及漢族的對比研究中，雖然相同級別宮頸病變中HPV E6蛋白表達(dá)在維吾爾族和漢族之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但本研究仍然觀察到在慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3維吾爾族患者中，HPV E6蛋白的陽性表達(dá)率高于漢族，并且HPV E7基因也發(fā)現(xiàn)相同的現(xiàn)象。維吾爾族在宮頸癌前各個級別病變中的HPV E6、E7的表達(dá)高于漢族，而HPV E6、E7蛋白高表達(dá)提示病程進(jìn)展，可能在HPV感染導(dǎo)致宮頸病變過程中，維吾爾族婦女相對不容易逆轉(zhuǎn)，更容易進(jìn)一步進(jìn)展。王薇等[15]使用實時定量的方法檢測維吾爾族和漢族E6、E7的載量，發(fā)現(xiàn)HPV E6、E7與維吾爾族和漢族宮頸病情進(jìn)展相關(guān)，具有預(yù)測宮頸病變轉(zhuǎn)歸的作用。近年來有學(xué)者通過檢測E6、E7 mRNA的轉(zhuǎn)錄來診斷和預(yù)測宮頸癌的發(fā)生，具有一定的診斷價值[16-17]，也說明在宮頸癌發(fā)生過程HPV E6、E7蛋白表達(dá)影響宮頸病變的進(jìn)展。但HPV E6、E7在致癌過程中如何作用還需要進(jìn)一步分子生物學(xué)研究。

綜上所述，HPV E6、E7蛋白是維吾爾族和漢族宮頸癌發(fā)展的重要因素，HPV E6、E7蛋白可能具有預(yù)測宮頸病變進(jìn)展的價值。

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Expression of HPV E6/E7 proteins in cervical carcinoma of Uygur and Han women and its significance

WANG LinHAN LiliMayinuer·Niyazi▲SUI Shuang
Department of Gynecology,the People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumchi830001,China

Objective To analyze the relation between the expression of HPV E6/E7 gene and cervical cancer progression in Uyghur and Han women and to compare the difference expression of HPV E6/E7 gene between Uygur and Han women.Methods Total of 133 paraffin-embedded tissues of cervix were collected from the People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region from April 2013 to April 2014 were recruited,and all the cases were confirmed by the histological diagnosis.Immuno-histochemistry was performed to detect the expressions of HPV16 E6 and E7 proteins including 75 Uygur and 58 Han.The correlation between expression of HPV E6,E7 protein and lesion grade of cervical was analyzed by spearman rank correlation,and to compare the difference of HPV E6,E7 protein expression between Chinese and Uygur by χ2trest.Results The expression rate of HPV E6 proteins were increased with the development of from chronic inflammation to caner in Uygur and Han women,respectively,there were significant difference (χ2=39.61,P=0.001;χ2=19.77,P=0.001);further using Spearman rank correlation found the significant positive correlation between expression of E7 proteins and lesion grade of cervical(r=0.708,P=0.001;r=0.729,P=0.001).The expression rate of HPV E7 proteins were increased with the disease development from chronic inflammation to caner in Uygur and Han women,respectively,there were significant differences(χ2=32.48,P=0.001;χ2=24.16,P=0.001),further using Spearman rank correlation found significant positive correlation between expression of E7 proteins and lesion grade of cervical(r=0.649,P=0.001;r=0.759,P=0.001).In the inflammatory group,CIN 1,CIN 2-3,positive expression rate of E6,E7 protein in Uygur women was higher than that of Han women;in cervical cancer group,the expression rate of E6,E7 protein in Uygur women was lower than that of Han women,but the difference was not statistically significant(P＞0.05).Conclusion HPV E6,E7 protein were important factors in the development of cervical cancer in Uygur and Han women.HPV E6,E7 proteins may have a prediction value in development of cervical lesion.

HPV;E6 protein;E7 protein;Cervical cancer;Uygur nationality;Han nationality

R737.33

A

1673-7210（2015）07（c）-0075-04

2015-03-02本文編輯：任念）

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院：內(nèi)課題（2011 0106）。

▲通訊作者