黃精“九蒸九制”炮制過程中多糖及皂苷的含量變化

楊圣賢，楊正明，陳奕軍，黃艷菲，何麗華，張志鋒，陳 蓉

（1.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，成都 610041；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013）

黃精為百合科黃精屬植物，始載于《名醫(yī)別錄》，其來(lái)源為滇黃精Polygonatum kingianum CoLL.et HemsL、黃精P.sibiricum Red 或多花黃精P.cyrtonema Hua 的干燥根莖。多為本草生植物，按形狀不同，習(xí)稱“大黃精”、“雞頭黃精”、“姜形黃精”。性味甘、平，入脾、腎、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎［1］等功能，用于滋補(bǔ)強(qiáng)身，腎虛精虧，肺虛燥咳以及脾胃虛弱之證，是中醫(yī)常用滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥，研究發(fā)現(xiàn)黃精尚具有降血壓、降血糖、降血脂［2］、抗腫瘤［3］。

黃精的炮制方法多達(dá)二十余種，其中以蒸煮法為主，如單蒸、重蒸、九蒸九曝、加輔料蒸制等，近代炮制方法還有黑豆制，熟地制，蜂蜜制，生姜制等。由于生黃精具有麻味，服用生品時(shí)，口舌麻木，刺激咽喉。所以蒸制最早的目的是去除其刺激性，便于長(zhǎng)期保存。在《中藥炮制大全》和《中國(guó)藥典》（2010 版）中均沒有對(duì)黃精九蒸九制炮制方法的記錄，現(xiàn)代學(xué)者朱衛(wèi)平［4］提出了“潤(rùn)、蒸、燜、拌汁”的新方法，劉超［5］等對(duì)黃精炮制法提出改進(jìn)即“潤(rùn)－蒸－燜”，龐玉新［6］、吳文遠(yuǎn)［7］等也對(duì)黃精炮制方法提出了不同程度的改進(jìn)，但他們均沒有涉及到九蒸九制黃精的炮制方法。目前也鮮有對(duì)黃精九蒸九制的炮制機(jī)理進(jìn)行研究的文獻(xiàn)，因此本文通過紫外-可見分光光度法來(lái)探究黃精九蒸九制過程中每一蒸制多糖和皂苷含量的變化，擬從多糖和皂苷的含量隨蒸制次數(shù)增加的變化規(guī)律來(lái)考證九蒸九制的炮制機(jī)理和意義，為黃精的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

黃精、葡萄糖對(duì)照品、薯蕷皂苷元對(duì)照品（中國(guó)藥品檢驗(yàn)所，批號(hào)1405106），香草醛、蒽酮、冰醋酸、高氯酸、濃硫酸、氯仿、甲醇、乙醇以及其他試劑均為分析純，水為純凈水。

DHG-9246 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ-250B 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240S 梅特勒電子分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；IKA RV8 V 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司（IKA 中國(guó)））；HX-200 型高速中藥粉碎機(jī)（浙江永康溪岸五金藥具廠）；TGL-16 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）。普析TU-1950 紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備將新鮮的黃精去除雜質(zhì)及須根，洗凈晾干，切厚片，分九份并做好標(biāo)記。稱量并記錄新鮮黃精重量，然后將其清蒸6 小時(shí)，取出放入45℃的烘箱內(nèi)，烘至重量不再減少。重復(fù)操作9 次，分別得到1，2，3……9 蒸制黃精，九蒸九制過程中黃精的重量變化如圖1 所示?？瞻捉M是新鮮黃精直接烘干即稱為0 蒸。

圖1 黃精九蒸九制過程中重量的變化

由圖1 可知，在九蒸九制過程中，黃精樣品在一蒸一制后重量明顯減少，大約減少了70%左右，之后黃精樣品的質(zhì)量減少緩慢。

2.2 多糖的測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品20.25mg，置于100mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2025mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下葡萄糖對(duì)照品溶液0.08mL、0.12mL、0.16mL、0.20mL、0.24mL、0.28mL、0.32mL、0.36mL、0.40mL，分別置于具塞比色管中，依次加蒸餾水至2.0mL，加入新鮮配置的2%的蒽酮-硫酸4mL，搖勻，立即放入沸水中10min，取出，立即在冰水浴中10min，以蒸餾水為空白溶劑同法操作作為空白對(duì)照，在624nm 處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.0168x+0.0549，R2=0.9998，在4.05～40.5μg/mL 范圍內(nèi)吸光度與質(zhì)量濃

度線性關(guān)系良好。

2.2.3 樣品溶液的制備準(zhǔn)確稱取0～9 蒸的黃精粉末1.0g，分別置于100mL 的圓底燒瓶中，加入95%乙醇40mL，在80℃的恒溫水浴鍋內(nèi)回流1h，除去脂溶性成分，過濾，揮干乙醇，分別加20mL 蒸餾水，置75℃的恒溫水浴鍋內(nèi)回流提取2.5h，趁熱過濾，殘?jiān)谜麴s水洗滌3 次，合并濾液和洗液，減壓濃縮其體積的1/5 倍，加相當(dāng)于溶液體積6 倍的無(wú)水乙醇，多糖呈絮狀沉淀析出，靜置24h，離心，過濾，得到黃精的粗多糖，45℃烘干。取適量粗多糖用蒸餾水溶解定容至50mL，搖勻，即得。

2.2.4 九蒸九制黃精中多糖含量的測(cè)定準(zhǔn)確吸取一定量的2.2.3 制備的黃精多糖溶液，按照“2.2.2”顯色條件測(cè)其吸光度（Y），由回歸方程計(jì)算多糖溶液的濃度，計(jì)算黃精中多糖的含量。

圖2 0～9蒸黃精的多糖含量變化

由圖2 可知，直接烘干的0 蒸黃精多糖含量為12%，九蒸九制過程中，1 蒸黃精的多糖含量為8.89%，1～3 蒸間多糖含量明顯減少，3～9 蒸間多糖的含量趨于穩(wěn)定，基本在1%左右。

2.3 皂苷的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的薯蕷皂苷元對(duì)照品5.11mg，置于10mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.511mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.70mL，分別置于具塞比色管中，60℃的水浴鍋揮干，加入新鮮配置的5%的香草醛冰醋酸0.2mL，高氯酸0.8mL，搖勻，立即放入60℃的水浴鍋10min，取出，立即在冰水浴中5min，取出，加5mL冰醋酸，以不加空白溶劑同法操作作為空白對(duì)照，在545nm 處測(cè)定吸光度。以薯蕷皂苷元質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=12.097x+0.0918，R2=0.9996，在4.25～59.62μg/mL 范圍內(nèi)吸光度與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn)精密吸取薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液6 份各0.7mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，測(cè)定吸光度。RSD=1.31%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液1mL，按對(duì)照品溶液測(cè)定方法，在0，0.5，1，1.5，2h 測(cè)定一次吸光度，RSD=1.1%。結(jié)果表明，供試品在2 h 以內(nèi)穩(wěn)定，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)取供試品溶液，按對(duì)照品溶液測(cè)定方法，重復(fù)測(cè)定6 次，RSD=0.19%。結(jié)果表明，此法的重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率精密吸取已知9 蒸黃精皂苷溶液0.02mL，平行6 次，各加入薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液0.181mL，測(cè)定總皂苷含量，計(jì)算回收率，結(jié)果：平均加樣回收率是103.00%，RSD 為5.39%。

2.4 超聲輔助提取工藝

2.4.1 溶劑單因素考察考慮到以往最常用的皂苷提取溶劑，試驗(yàn)以75%甲醇、甲醇、75%乙醇、95%乙醇為溶劑，采用超聲輔助提取方法，平行試驗(yàn)，以皂苷的含量為指標(biāo)，初選提取溶劑，結(jié)果：以75%甲醇提取的皂苷含量為11.24%，甲醇的為11.09%，75%乙醇的為12.08%，95%乙醇的為9.13%。結(jié)果表明95%乙醇和甲醇對(duì)于本品提取效果較差，75%乙醇對(duì)皂苷的提取效果最好，因此我們選用75%乙醇作為提取溶劑。

2.4.2 正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和影響超聲輔助提取的主要參數(shù)，選取提取溶劑（A）、浸提溫度（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）作為考察因素，每個(gè)因素選用3 個(gè)水平，確定因素水平見表1，以黃精皂苷含量為考察指標(biāo)，采用正交表L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，按照正交表的條件對(duì)二蒸二制的黃精進(jìn)行提取，具體操作方法如下：取黃精1.00g，加乙醇15mL，浸提，超聲，過濾，減壓濃縮至干，適量甲醇溶解，離心，轉(zhuǎn)移到25mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得，準(zhǔn)確吸取皂苷溶液0.04ml，按照“2.3.2”顯色條件測(cè)其吸光度（Y），由回歸方程計(jì)算皂苷溶液的濃度，計(jì)算黃精中皂苷的含量。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

表2 黃精總皂苷正交試驗(yàn)表

表2 結(jié)果表明，提取次數(shù)（D）和浸提溫度（B）對(duì)中皂苷的含量影響最大，提取時(shí)間（C）對(duì)黃精中總皂苷的含量影響最小。因此可以得出4 個(gè)因素對(duì)提取黃精中皂苷的主次影響順序?yàn)锽=D＞A＞C，確定黃精中皂苷含量的最佳提取工藝為D3B3C3A1，即85%乙醇，浸提溫度70℃，超聲時(shí)間40min，超聲一次。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)按照上述最佳優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3 次，黃精中皂苷含量的平均值為167.76mg，RSD=1.76%，表明該工藝重現(xiàn)性良好。

2.4.4 皂苷含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取以上炮制的0～9 蒸黃精細(xì)粉末各1.00g，按最佳超聲輔助提取工藝組合進(jìn)行提取，準(zhǔn)確吸取一定的黃精皂苷溶液，按照“2.3.2”顯色條件測(cè)其吸光度（Y），由回歸方程計(jì)算總皂苷溶液的濃度，計(jì)算 ～ 蒸黃精中皂苷的含量。

圖3 0～9蒸黃精超聲輔助提取總皂苷含量變化曲線

由圖3 可知，超聲輔助提取的0～4 蒸黃精皂苷的含量增加明顯，增加了近7 倍，而4～9 蒸皂苷含量趨于穩(wěn)定，約為14%左右。

3 討論

0～9 蒸黃精的多糖、皂苷提取液的顏色有明顯的不同，0 蒸黃精的提取液為無(wú)色，1～4 蒸逐漸變成紅褐色，4～9 蒸為紅褐色，這種顏色是否對(duì)紫外分光光度檢測(cè)有影響。雖然9 蒸的多糖含量和4 蒸的一樣，但是是否4 蒸黃精的藥用效果也和9 蒸的一樣，這個(gè)需要做進(jìn)一步的研究。在何首烏的清代《藥品辨義》中記載：“久蒸制熟，成紫黑色”。筆者不禁想問九蒸九制是否在古代是久蒸久制，九蒸九制中的九僅僅代表的只是蒸制時(shí)間的長(zhǎng)短，并非是說蒸制九次，也可以認(rèn)為九是最大的一位數(shù)，九蒸九制還是強(qiáng)調(diào)蒸制時(shí)間的長(zhǎng)短而并非蒸制的次數(shù)，這有待于進(jìn)一步的考證。

直接烘干的黃精多糖含量最高，炮制過后多糖含量有明顯的降低，這是因?yàn)槎嗵谴罅克獬傻途厶?、單糖，有利于有效成分的煎出及藥效的充分發(fā)揮，單從多糖的含量上，9 蒸黃精和4 蒸的多糖含量基本一樣。得到直接烘干的0 蒸黃精中皂苷含量最少，炮制后的皂苷含量逐步增加，四蒸四制后皂苷含量就基本穩(wěn)定。單從皂苷含量上，黃精四蒸四制就可以，所以綜合多糖和皂苷的含量考慮，四蒸四制的黃精最好。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，得到黃精皂苷超聲輔助最佳提取工藝，即85%乙醇，浸提溫度70℃，超聲時(shí)間40min，超聲一次。超聲輔助提取與傳統(tǒng)的醇提法相比，可以縮短提取時(shí)間，節(jié)省溶劑，提高有效成分的提取效率，簡(jiǎn)化提取操作步驟。在現(xiàn)代文獻(xiàn)中黃精的炮制以蒸制為主，同時(shí)出現(xiàn)了各種減少蒸制次數(shù)的方法，但關(guān)于炮制工藝的標(biāo)準(zhǔn)并不相同，蒸制和烘干的次數(shù)也不相同，相互間也沒有比較，希望本文為黃精的九蒸九制炮制工藝提供理論支持。

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