靖江香沙芋組織培養(yǎng)快繁技術(shù)

韓曉勇　宋婷婷　王立　等

摘要：以靖江香沙芋莖尖為外植體進(jìn)行快速繁殖技術(shù)研究。結(jié)果表明，75%乙醇浸泡30 s和84消毒液消毒10～15 min配合使用滅菌效果最好；芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L TDZ，培養(yǎng)25 d后芽誘導(dǎo)率最高，為80%，芽高度為2.3 cm；繼代增殖最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L TDZ，月增殖倍數(shù)可達(dá)4.3；生根培養(yǎng)最適培養(yǎng)基為1/2MS+01 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.02%活性炭，平均生根時(shí)間為11 d，生根率達(dá)100%，根系最長(zhǎng)為2.9 cm；生根培養(yǎng)45 d，將試管苗移入營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)，30 d后移栽成活率達(dá)100%。

關(guān)鍵詞：靖江香沙芋；組織培養(yǎng)；芽誘導(dǎo)；快繁

中圖分類號(hào)： S632.304+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0050-03

收稿日期：2014-03-03

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（12）2008]。

作者簡(jiǎn)介：韓曉勇（1983—），男，山西忻州人，碩士，助理研究員，從事特色經(jīng)濟(jì)作物組織培養(yǎng)技術(shù)研究。E-mail：hanxy84@163.com。

通信作者：殷劍美，博士，研究員，主要從事特色經(jīng)濟(jì)作物研究。Tel：（025）84390860；E-mail：yinjm2006@sohu.com。靖江香沙芋屬天南星科（Araceae）芋屬（Colocasia） 多子芋類型，是靖江市農(nóng)民栽培的芋類作物當(dāng)家品種。其塊莖中淀粉含量高，既可以當(dāng)糧食，又可做蔬菜，是老幼皆宜的滋補(bǔ)品，并含有多種維生素，有一股獨(dú)特的香味。加工前景廣闊，聞名并暢銷廣西、廣東及港、澳地區(qū)。靖江香沙芋通常采用母芋留種方式進(jìn)行繁殖，種性退化問(wèn)題較為突出，抗病性和抗逆性減退。建立靖江香沙芋組培再生體系，不僅有利于品種的更新復(fù)壯，更可為種苗工廠化生產(chǎn)和新品種選育提供技術(shù)支持與儲(chǔ)備。

近年來(lái)，芋組織培養(yǎng)已相繼開展，對(duì)其莖尖和葉片等不同外植體培養(yǎng)進(jìn)行了廣泛的研究[1-5]。但這些研究主要圍繞外植體愈傷誘導(dǎo)及植株再生，而愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中易發(fā)生變異，不利于保持本品種的優(yōu)良特性。本研究旨在建立一種從芽直接到多芽體，多芽體到試管苗的繁殖方式。這種繁殖方式不僅可以提高繁殖系數(shù)和繁殖速度，而且利于保持本品種的優(yōu)良特性，可有效保護(hù)具有地方特色的種質(zhì)資源。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為靖江香沙芋芋莖尖。

1.2方法

1.2.1無(wú)菌材料的處理選取保存完好、無(wú)腐爛斑點(diǎn)的芋，經(jīng)0.2%的K2MnO4消毒5 min后整齊排列在周轉(zhuǎn)箱中，用沙子覆蓋到整個(gè)芋塊的2/3處，放置到光照培養(yǎng)箱中催芽。待芽生長(zhǎng)到1～3 cm時(shí)切取莖尖，剝除外層2～3層葉片，流動(dòng)水沖洗10 min，在超凈臺(tái)上用75%乙醇浸泡30 s，分別用NaClO、84 消毒液2種消毒劑，NaClO設(shè)10、15、20 min，84消毒液設(shè)5、10、15 min 3個(gè)時(shí)間段處理滅菌，每種處理分別接種12個(gè)莖尖于MS培養(yǎng)基中，觀察滅菌效果。

1.2.2芽誘導(dǎo)分化外植體經(jīng)滅菌后接種在添加不同濃度的6-BA和NAA及TDZ和IBA組合的MS培養(yǎng)基中，接種25 d后比較芽的分化率、芽高度及葉片數(shù)等確定適宜芽分化的培養(yǎng)基。激素濃度設(shè)置7個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)接種15個(gè)莖尖。

1.2.3繼代增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)出的不定芽長(zhǎng)到2 cm左右時(shí)，切取單芽接種在添加不同濃度的6-BA和NAA及TDZ和IBA組合的MS培養(yǎng)基中，30 d時(shí)觀察其增殖倍數(shù)。激素濃度設(shè)置6個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)接種20個(gè)單芽。

1.2.4生根將高2.0 cm以上、帶有2張或2張以上葉的健壯小苗切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。生根基本培養(yǎng)基為1/2MS并添加0.02%活性炭。調(diào)查不同處理的平均生根時(shí)間，30 d的生根數(shù)、生根率、葉片數(shù)、根系平均長(zhǎng)度及根系形態(tài)。生根培養(yǎng)基設(shè)置4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)接種15個(gè)小苗。

1.2.5煉苗與移栽生根培養(yǎng)45 d的再生苗在室外常溫下放置5 d后，打開瓶蓋煉苗1～2 d。將根系發(fā)達(dá)、株高5～12 cm 的再生苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去根部的培養(yǎng)基，移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，并置于相對(duì)濕度80%～90%、溫度20～25 ℃的環(huán)境中遮陰培養(yǎng)1周，2周后正常光照培養(yǎng)，30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.6培養(yǎng)基滅菌及培養(yǎng)條件高壓滅菌前調(diào)整培養(yǎng)基pH值為5.8，保持121 ℃滅菌20 min。培養(yǎng)室溫度為（25±2） ℃，光照度2 000～3 000 lx，每天光照12 h。培養(yǎng)基中瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7 g/L，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 g/L。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒液和滅菌時(shí)間對(duì)外植體滅菌效果的影響

從表1可以看出，外植體用84消毒液滅菌10～15 min效果最好，滅菌成功率達(dá)83.3%以上。NaClO滅菌成功率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于84消毒液。

表1不同消毒液和滅菌時(shí)間對(duì)外植體滅菌效果的影響

消毒劑種類時(shí)間

（min）接種莖段數(shù)

（個(gè)）污染數(shù)

（個(gè)）污染率

（%）NaClO1012650.01512433.32012325.084消毒液512650.01012216.7151218.3

2.2芽誘導(dǎo)分化

從表2可以看出，MS+0.5 mg/L TDZ和MS+1.0 mg/L TDZ培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)率及芽長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于另外幾種培養(yǎng)基。其中以MS+0.5 mg/L TDZ培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)率最高，為80%，芽高度為2.3 cm（圖1-A）。TDZ與6-BA 2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)芋芽誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響差異較大，與6-BA相比，TDZ對(duì)芽分化率及株高差異都達(dá)到顯著水平，經(jīng)25 d就能誘導(dǎo)莖尖長(zhǎng)成2～3張葉。隨著6-BA與NAA配比濃度的提高，芽分化率呈上升趨勢(shì)，但株高及展開葉數(shù)呈下降趨勢(shì)。當(dāng) 6-BA ∶NAA=4.0 ∶0.2時(shí)，葉片容易發(fā)生卷曲。表2不同激素濃度和激素種類對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

激素種類及濃度接種數(shù)

（個(gè)）分化數(shù)

（個(gè)）分化率

（%）株高

（cm）展開葉數(shù)

（張）植株表現(xiàn)6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L154c26.7c1.4c1b芽矮小6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L153c20.0c1.3c1b芽矮小6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L157b46.7b1.8b2ab芽矮小6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L157b46.7b1.4c1b葉片卷曲TDZ 0.5 mg/L+IBA 0.0 mg/L1512a80.0a2.3a3a正常TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.0 mg/L1511a73.3a2.3a3a正常TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.4 mg/L158b53.3b1.7b2ab芽粗短注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。表3、表4同。

2.3繼代增殖

由表3 可以看出，誘導(dǎo)叢生芽增殖最適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L TDZ，叢生芽分化速度快，增殖倍數(shù)可達(dá)4.3（圖1-B），與其他處理差異顯著。方差分析結(jié)果顯示，TDZ對(duì)芽增效系數(shù)顯著高于6-BA。隨著6-BA與NAA配比濃度的提高，增殖系數(shù)呈先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)6-BA ∶NAA=4.0 ∶0.2 時(shí)，增殖系數(shù)和芽均較小。

2.4生根培養(yǎng)

由表4可以看出，不同激素濃度對(duì)組培苗生根影響較大。其中激素濃度為6-BA ∶NAA=0.1 ∶0.5時(shí)生根效果最好，平均生根時(shí)間為11 d，生根率達(dá)100%，30 d的根系長(zhǎng)度、葉片數(shù)以及株高均顯著高于其他處理，分別為2.9 cm、3.5張和5.6 cm（圖1-C）。隨著NAA濃度增大，根系長(zhǎng)度、葉片數(shù)和株高都有不同程度的下降，根系逐漸變短變粗，最終呈雞爪

表3不同激素濃度和激素種類對(duì)芽增殖的影響

激素種類激素濃度

（mg/L）接種數(shù)

（個(gè)）芽數(shù)

（個(gè)）增殖系數(shù)生長(zhǎng)描述6-BA/NAA1.5/0.22034e1.7e芽較小2.0/0.22042d2.1d芽較大4.0/0.22032e1.6e芽很小TDZ/IBA0.5/0.02078b3.9b正常1.0/0.02086a4.3a正常1.0/0.42075c3.75c易生根

狀，并伴有少量氣生根出現(xiàn)。組培苗培養(yǎng)45 d左右（圖1-D）移入苗床營(yíng)養(yǎng)土中，15 d后開始長(zhǎng)出新葉，30 d時(shí)成活率達(dá)100%（圖1-E）。

3討論

TDZ（苯基噻二唑基脲）是一種人工合成的苯基脲重氮噻唑取代衍生物。Mok等首次發(fā)現(xiàn)TDZ有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性，濃度很低的TDZ能促進(jìn)利馬豆（lima bean）愈傷組織生長(zhǎng)[6]。Chand等發(fā)現(xiàn)，在芋莖尖分生組織培養(yǎng)中，與BA相表4不同激素濃度對(duì)生根的影響

NAA

（mg/L）6-BA

（mg/L）接種數(shù)

（個(gè)）生根時(shí)間

（d）生根苗數(shù)

（苗）生根率

（%）平均根長(zhǎng)

（cm）葉片數(shù)

（張）株高

（cm）植株表現(xiàn)0.50.1151115100a2.9a3.50a5.6a細(xì)長(zhǎng)1.00.1151315100a1.7b2.80b3.4b粗短2.00.1151315100a1.2c2.25c2.8c雞爪狀，氣生根4.00.1151315100a1.0c2.50bc2.9c雞爪狀，氣生根

比，MS培養(yǎng)基中添加一定濃度的TDZ可以增強(qiáng)外植體的活力[7]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與6-BA相比，TDZ更適于促進(jìn)芋莖尖萌動(dòng)、生長(zhǎng)及叢生芽增殖，與崔瑾等得出的TDZ在不同基因型芋組織培養(yǎng)的生理效應(yīng)和TDZ對(duì)莖尖生長(zhǎng)的影響結(jié)論[8-9]一致。適宜靖江香沙芋芽分化的培養(yǎng)基為MS+0.5～1.0 mg/L TDZ，其中以MS+0.5 mg/L TDZ的培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)率和芽的高度方面表現(xiàn)最好；叢生芽增殖最適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L TDZ，叢生芽分化速度快，增殖倍數(shù)可達(dá)4.3。林文麗等在海門香沙芋的組織培養(yǎng)中認(rèn)為TDZ與IBA適當(dāng)濃度配比有利于叢生芽的增殖[2]，本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加IBA反而利于組培苗生根，形成差異的原因可能與品種的基因型有關(guān)。

在一定濃度范圍內(nèi)，提高NAA濃度有利于試管苗生根。但NAA濃度不能太高，當(dāng)NAA濃度高于2.0 mg/L時(shí)，根系長(zhǎng)度、葉片數(shù)和株高都出現(xiàn)不同程度的下降，說(shuō)明高濃度NAA對(duì)試管苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，這種抑制作用隨著NAA濃度的升高而越加明顯[10]。外植體在培養(yǎng)過(guò)程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞里的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，有時(shí)使整個(gè)培養(yǎng)基變褐，從而抑制其他酶的活性，影響材料的培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中加入0.02%的活性炭抗氧化吸附，并勤換培養(yǎng)基可以減少褐化[11]。

本研究中靖江香沙芋莖尖離體培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生叢芽但未見愈傷組織的產(chǎn)生，這種直接通過(guò)“芽生芽”的方式獲得與親本類似的幼苗，可以減少變異的可能，有效保護(hù)具有地方特色的種質(zhì)資源，這與張曉蘭等的觀點(diǎn)[4]一致。

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