郝貴杰　王春琳　林鋒　等

摘要：對三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血清凝集素的凝集特性進行了研究。結果表明： 三疣梭子蟹血清凝集素對鯽魚、中華鱉、草魚、雞和人類A、B、O型血細胞沒有凝集作用，但是對小鼠、兔的血細胞表現(xiàn)出較強的凝集活性，其中對小鼠血細胞的血凝活性達到210，對兔血細胞的血凝活性達到28；鹽度對其凝集活性有較大影響，NaCl濃度在0.6 mol/L以上時基本失活；凝集素活性最適pH 值為6.0～7.4；血清凝集素對Ca2+、Mg2+離子有明顯的依賴性，EDTA可以明顯抑制其凝集活性；糖抑制結果表明，血清凝集素活性能被N-乙酰葡萄糖胺及N-乙酰甘露糖胺特異性抑制；對血清凝集素進行硫酸銨分級沉淀分離后，發(fā)現(xiàn)凝集素活性主要分布在25%飽和度硫酸銨沉淀區(qū)；聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）結果表明，主要蛋白條帶在72～95 ku。

關鍵詞：三疣梭子蟹；血清凝集素；凝集活性；聚丙烯凝膠電泳

中圖分類號： S966.16文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0220-04

收稿日期：2014-08-14

基金項目：國家自然科學基金（編號：41106123）；國家“863”計劃（編號：2012AA10A409）；浙江省自然科學基金（編號：LY12C19009）；浙江省科技廳重大科技專項（編號：2012C12907-3） 。

作者簡介：郝貴杰（1979—），女，安徽六安人，碩士，副研究員，主要從事水生動物病害及免疫學研究。 E-mail：melissa511@sina.com。

通信作者：沈錦玉，碩士，研究員，主要從事水生動物病害及免疫學研究。E-mail： shenjinyu@126.com。三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是一種重要的海洋經(jīng)濟動物，隸屬甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、梭子蟹科（Portunidae）、梭子蟹屬（Portunus），廣泛分布于中國、日本等海域[1]，因其具有生長快、肉質好的特點，深受國內(nèi)外消費者的喜愛。近年來隨著育苗和養(yǎng)殖技術的日臻成熟，梭子蟹養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加，目前已成為沿海各省海水養(yǎng)殖的主導產(chǎn)品。然而由于梭子蟹養(yǎng)殖規(guī)模的逐年增加，養(yǎng)殖環(huán)境的變化等已對其免疫防御系統(tǒng)造成了影響，導致梭子蟹自身抗病力下降，對病害的易感性增加。例如近年來由弧菌引起的“牙膏病”“乳化病”給梭子蟹帶來較大危害，也造成了該產(chǎn)業(yè)重大經(jīng)濟損失，嚴重制約了梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[2-3]。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖戶多用抗生素防治病害，但從使用抗生素等藥物的安全性、抗藥性以及對水環(huán)境的不良影響等方面考慮，研究梭子蟹的免疫機制，有效提高蟹本身的抗病能力，顯得越來越重要。

三疣梭子蟹屬于甲殼類動物，無特異性免疫應答，非特異性免疫包括細胞免疫和體液免疫，凝集素是甲殼類動物體液免疫中的一種重要免疫因子[4]，其作用就相當于脊椎動物中的抗體[5-6]，具有重要的免疫作用，例如可對外來病原菌具有選擇性凝集作用，可通過調理和介導血細胞發(fā)揮吞噬外來物質的作用，能夠協(xié)同機體的其他免疫因子抵御外來病原入侵[7]。隨著甲殼類養(yǎng)殖的增加及病害的增多，對養(yǎng)殖對蝦、貝類以及鱟的凝集素研究已有較多報道[8-14]，但對三疣梭子蟹凝集素的研究較少[15-16]，而同屬蟹類的中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、鋸緣青蟹（Scylla serrata）的報道很多[17-22]。本研究對三疣梭子蟹血清凝集素開展相關研究，包括其血凝譜、凝集條件、影響因素及凝集素的鹽析純化等，旨在為深入研究三疣梭子蟹血清凝集素類型、分布、功能，闡明凝集素在三疣梭子蟹免疫中的作用機制提供基礎資料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試動物及血液三疣梭子蟹取自浙江省寧波象山鑫億鮮活水產(chǎn)品有限公司，體質量150 g左右；新西蘭大白兔、ICR小鼠購自浙江省醫(yī)學院動物中心；鯽魚、草魚、雞、中華鱉購自浙江省湖州市農(nóng)貿(mào)市場，人的A、B、O型血由湖州市中心血站提供。

1.1.2試驗藥品及試劑N-乙?；被咸烟牵∟-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）、N-乙酰氨基甘露糖（N-acetyl-D-mannosamine，ManNAc）、葡萄糖、木糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、乳糖、D-半乳糖、果糖均為Sigma進口分裝。Alservers抗凝劑、pH值7.4 Tris-HCl（TBS-Ⅰ 含Ca2+，TBS-Ⅱ不含Ca2+）等按文獻[23]方法配制。

1.2方法

1.2.1三疣梭子蟹血清制備用剪刀剪斷三疣梭子蟹的步足關節(jié)柔軟處，收集血淋巴于玻璃平皿中，室溫靜置2～3 h，4 ℃ 冰箱過夜，將其分裝于離心管中，6 000 r/min 、4 ℃離心10 min，吸取上層血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2動物血細胞制備以Alservers抗凝劑潤洗注射器抽血，小鼠和中華鱉為心臟采血，兔為耳靜脈采血，雞為翅下靜脈采血，鯽魚和草魚為尾靜脈采血。抗凝血液保存于4 ℃冰箱中，用前3 000 r/min 離心3 min，取血細胞以0.85%生理鹽水洗3次后，配制成2%（體積比）血細胞懸液，用于凝集試驗。

1.2.3血清凝集素凝集譜的測定在96孔微量血凝板中進行測定血清凝集素凝集譜。每孔加入25 μL TBS-Ⅰ，取 25 μL 血清樣品進行連續(xù)2倍稀釋，再加入25 μL 2%血細胞，室溫靜置1～2 h，按文獻[24]方法觀察記錄紅細胞凝集情況。

1.2.4鹽度對血凝效價的影響配制不同鹽度的TBS-Ⅰ（0.15～1.35 mol/L NaCl），各取25 μL加至微量板中，再以2倍梯度稀釋待測三疣梭子蟹血清樣品，加入相同體積的2%小鼠血細胞，按上述方法測定血清凝集效價。

1.2.5pH值對血凝效價的影響分別用1 mol/L HCl和 1 mol/L NaOH將TBS-Ⅰ的pH值調為3.0、4.0、5.0、6.0、70、7.4、8.0、9.0、10.0，取不同pH值的TBS-Ⅰ 25 μL分別加至微量板中，再以2倍梯度稀釋待測血清樣品，加入等量的2%小鼠血細胞，室溫靜置1～2 h，測定血清凝集效價。

1.2.6Ca2+、Mg2+、EDTA對血凝效價的影響分別以TBS-Ⅱ配制含20 mmol/L Ca2+、20 mmol/L Mg2+、20 mmol/L EDTA的3種溶液，另設1組對照，分別取上述4種溶液 25 μL 加至微量板中，再以2倍梯度稀釋待測三疣梭子蟹血清樣品，加入等體積2%小鼠血細胞，測定血清凝集效價。

1.2.7糖抑制試驗分別以TBS-Ⅰ配制200 mmol/L葡萄糖、木糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、乳糖、D-半乳糖、果糖、GlcNAc溶液以及200、400 mmol/L ManNAc溶液，分別取各溶液25 μL加至微量板中，再以2倍梯度稀釋待測三疣梭子蟹血清樣品，先在37 ℃中溫育30 min，加入 等體積的2%小鼠血細胞，測定血清凝集效價。

1.2.8血清的飽和硫酸銨溶液分級沉淀取血清樣品 10 mL，用PBS溶液稀釋至2倍，置于電磁攪拌器上攪拌，逐滴加入飽和硫酸銨溶液6.7 mL，邊加邊攪拌，4 ℃沉淀過夜。第2天把沉淀溶液分裝于7 mL離心管，4 ℃、4 000 r/min離心30 min。將所得沉淀加入適量的PBS溶解，轉移到透析袋中，透析2 d（間隔6～8 h換1次PBS溶液），最后得到的溶液就是血清經(jīng)25%飽和硫酸銨沉淀的鹽析成分。然后根據(jù)離心后上清液的量，加入適量飽和硫酸銨溶液，用相同方法分別得到30%、40%、50%、60%的飽和硫酸銨沉淀的血清鹽析成分，用蛋白測定儀分別測定各組分蛋白濃度。

1.2.9不同鹽析組分的凝集特性及糖抑制特性分別按照“1.2.3”節(jié)、“1.2.7”節(jié)的方法測定飽和硫酸銨溶液沉淀的各鹽析組分對不同動物血細胞凝集效價及其糖抑制特性。

1.2.10SDS-PAGE電泳按照Laemmli方法[25]，灌注 1 mm 厚5%濃縮膠和12%分離膠的不連續(xù)SDS-PAGE膠，根據(jù)濃度稀釋各樣品，并分別加入4×上樣緩沖液，煮沸3～5 min，用微量取樣器取10～20 μg蛋白上樣，垂直電泳槽恒壓80 V電泳，待跑至分離膠后，再將電壓調至110 V。電泳結束后用考馬斯亮藍快速染色液染色蛋白條帶，觀察結果并拍照。

2結果與分析

2.1血清凝集素對動物紅細胞的凝集譜

由表1可知，三疣梭子蟹血清凝集素對小鼠、兔、鯽魚、中華鱉、草魚、雞和人類A、B、O型血細胞均有不同程度凝集，其中以對小鼠血細胞的凝集效價最高，達210；其次是兔血細胞，

表1三疣梭子蟹血清及飽和硫酸銨沉淀組分血凝譜

2.2鹽度對血凝效價的影響

由圖1可知，在NaCl濃度是0.15 mol/L 時凝集活力最高；而隨著鹽度升高，凝集活力逐漸下降；當鹽度達到 0.6 mol/L 以上時，凝集活性被強烈抑制，凝集素已基本失去凝集活性。

2.3pH值對血凝效價的影響

由圖2可知，三疣梭子蟹血清在pH值為 6.0～7.4時凝集效價最高，為29；pH值低于6.0時凝集效價逐漸下降，pH值為4.0時凝集活性被強烈抑制，凝集素已基本失去凝集活性；pH值為8.0時凝集效價是28，pH值為9時凝集效價急劇下降，為20，基本處于失活狀態(tài)。

2.4Ca2+、Mg2+、EDTA對血凝效價的影響

測定了在三疣梭子蟹血清中分別添加Ca2+、Mg2+、EDTA對其凝集活力的影響，結果表明分別添加20 mmol/L Ca2+、20 mmol/L Mg2+均對其凝集活力具有增強作用，其凝集效價由28提高到29；但是添加20 mmol/L EDTA后，血清凝集效價降為23，幾乎失去活性。這表明EDTA能夠在血清環(huán)境下強烈抑制凝集素的凝集活性，三疣梭子蟹血清凝集素對Ca2+、Mg2+有明顯的依賴性。

2.5糖抑制試驗結果

由表2可知，葡萄糖等9種常見糖對三疣梭子蟹血清的凝集活性有不同程度的抑制作用，其中N-乙?；咸烟前罚℅lcNAc）和N-乙酰甘露糖（ManNAc）對三疣梭子蟹凝集素的抑制作用最強，200 mmol/L濃度即能完全抑制其凝集活性；其次為乳糖、D-半乳糖、果糖、木糖、蔗糖、D-海藻糖，200 mmol/L 葡萄糖對血清凝集素的抑制作用較小。從表2還可見，各沉淀組分和GlcNAc或ManNAc結合時，受到的抑制作用最強。表明三疣梭子蟹的血清凝集素對GlcNAc和ManNAc有特異性的結合能力。

表2血清及硫酸銨沉淀組分糖抑制試驗結果

糖種類濃度

（mmol/L）凝集效價血清25%30%40%TBS-Ⅰ200292102525葡萄糖20026272424乳糖20024272224D-半乳糖20024262423木糖20024262324蔗糖20024252323D-海藻糖20024262323果糖20024252323GlcNAc2000232323ManNAc2000232323ManNAc4000232223

2.6飽和硫酸銨分級沉淀各組分的血凝譜

研究了25%、30%、40%、50%、60%飽和硫酸銨沉淀組分對動物血細胞的凝集活性，結果發(fā)現(xiàn)25%沉淀組分的凝集活性最高，顯示三疣梭子蟹凝集素主要在25%硫酸銨飽和度析出。與血清的血凝譜相比，在30%、40%組分時凝集活性已經(jīng)較低，而到50%和60%組分時已經(jīng)基本沒有凝集活性（表1）。

2.7SDS-PAGE電泳結果

各鹽析組分樣品以10 μg蛋白上樣，用考馬斯亮藍快速染色液染色蛋白條帶。由圖3可見，各泳道均有大量蛋白存在于72～95 ku，還須進一步純化得到單一凝集素條帶。

3結論與討論

目前關于三疣梭子蟹凝集素特性的研究較少，僅有報道比較了包括三疣梭子蟹在內(nèi)的3種梭子蟹血清凝集素的細胞凝集活性[16]。本研究較為系統(tǒng)地研究了三疣梭子蟹血清凝集素的特性，結果表明：三疣梭子蟹血清凝集素對鯽魚、中華鱉、草魚、雞和人類A、B、O型血細胞沒有凝集作用，但是對小鼠、兔的血細胞具有較高的凝集活性，其中對小鼠血細胞的凝集活性高達210，這與梁青龍等的報道[16]一致，但該文沒有選擇小鼠紅細胞，測出兔細胞的凝集活性最高。本研究結果也與郝珂等報道的有關鋸緣青蟹血清凝集素的凝集特性[21-22]相似。因此，選擇小鼠紅細胞作為研究三疣梭子蟹血清凝集素特性的指示細胞，三疣梭子蟹凝集活性隨著鹽度的升高而降低，在鹽度大于0.6 mol/L時基本失活；凝集素作用的最適pH值為 6.0～7.4。已有研究表明，無脊椎動物的血細胞凝集素在發(fā)揮凝集活動作用時，常須要一些二價金屬離子的參與[5]，本研究選擇常見的二價金屬離子Ca2+、Mg2+，結果表明梭子蟹的血清凝集素對Ca2+、Mg2+有明顯依賴性，而且金屬離子螯合劑EDTA可以明顯抑制其凝集活性，說明在三疣梭子蟹血清凝集素的凝集活動中，二價金屬離子是必不可少的。

甲殼類動物血清凝集素可與多種糖類發(fā)生特異性結合，凝集紅細胞的特性實際是和糖基位點發(fā)生作用，所以其結合也會被相應的糖類所抑制。本研究分析了三疣梭子蟹血清凝集素對9種常見糖的敏感性，發(fā)現(xiàn)GlcNAc、ManNAc可特異性抑制血清凝集素的活性，表明梭子蟹凝集素的主要識別位點為GlcNAc、ManNAc，該結果與文獻報道的N-乙酰基糖類和唾液酸類糖蛋白是甲殼類動物體內(nèi)凝集素具有特異性結合的主要2種糖基位點的結果[26]一致。

本研究采用（NH4）2SO4分級沉淀法對梭子蟹血清進行了初步分離，發(fā)現(xiàn)其凝集素的活力區(qū)主要在25%飽和（NH4）2SO4區(qū)，具有很高的凝集活性，并且對GlcNAc、ManNAc 有特異性結合。SDS-PAGE結果表明，純化蛋白集中存在于72 ～95 ku。50%飽和（NH4）2SO4區(qū)蛋白含量特別高，蛋白大小區(qū)域與25%飽和（NH4）2SO4區(qū)差不多，但其凝集活性很低，效價僅為21 ，推測該部分主要為梭子蟹的血藍蛋白成分。這與以往報道的蝦類血藍蛋白具有一定的凝集活性，可與脊椎動物紅細胞產(chǎn)生凝集反應的結果[27]有些不一致。本研究結果為進一步分離純化提取三疣梭子蟹血清凝集素及研究其特性和功能奠定了良好基礎。

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