EphB4和EphrinB2蛋白在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其意義

張 堅(jiān)

·論著·

EphB4和EphrinB2蛋白在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其意義

張 堅(jiān)

目的 探討人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中EphB4和EphrinB2蛋白的表達(dá)水平及其臨床意義。方法 選取10例正常人視網(wǎng)膜組織(正常組)及47例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本(病例組)，采用免疫組化法檢測(cè)兩組EphB4和EphrinB2蛋白的表達(dá)水平，并分析二者的表達(dá)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 病例組EphB4蛋白、EphrinB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常組(P<0.01)。EphB4與EphrinB2蛋白在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本的陽(yáng)性表達(dá)均與臨床分期、分化程度及視神經(jīng)浸潤(rùn)顯著相關(guān)：臨床分期較晚、未分化型、視神經(jīng)浸潤(rùn)者EphB4與EphrinB2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞比例高于臨床分期較早、分化型及視神經(jīng)未浸潤(rùn)者(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 EphB4和EphrinB2蛋白可作為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤惡性程度及視神經(jīng)浸潤(rùn)程度的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；EphB4蛋白；EphrinB2蛋白；基因表達(dá)調(diào)控,腫瘤

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是目前眼科常見(jiàn)的根發(fā)于胚胎型視網(wǎng)膜細(xì)胞的惡性腫瘤之一，同時(shí)也是幼齡群體中眼內(nèi)最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的惡性腫瘤[1]。分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和各種分子治療方法的日趨成熟，為當(dāng)前醫(yī)療人員在分子水平對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤進(jìn)行研究和治療提供了良好的技術(shù)和理論條件。生促紅素人肝細(xì)胞(Eph)激酶作為受體酪氨酸激酶中最大的亞家族，已被查明有8種配體和14種受體，以其基因序列的同源性及與配體Ephrin結(jié)合表現(xiàn)，Eph受體分為EphA與EphB兩類(lèi)，而Ephrin配體分為EphrinA與EphrinB 2個(gè)亞型[2]。本研究采用免疫組化SP法對(duì)10例正常視網(wǎng)膜組織與47例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤標(biāo)本中EphB4、EphrinB2蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，探討其在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后判斷等方面的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 以陜西省人民醫(yī)院病理科1998—2014年收集的47例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織(病例組)和10例正常人的視網(wǎng)膜細(xì)胞組織(正常組)作為研究對(duì)象。病例組男27例，女20例；年齡3個(gè)月～9歲，中位年齡4歲；臨床分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期9例，Ⅲ期17例，Ⅳ期9例，Ⅴ期5例；根據(jù)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中是否存在菊形團(tuán)排列分為分化型20例，未分化型27例；腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)視神經(jīng)25例，未浸潤(rùn)22例。正常組男6例，女4例；年齡6個(gè)月～6歲，中位年齡4歲。兩組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤病理標(biāo)本均源自陜西省人民醫(yī)院病理科收集的、經(jīng)病理檢查證實(shí)為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者；正常標(biāo)本來(lái)自本院健康體檢者。排除標(biāo)準(zhǔn)：未經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的標(biāo)本，臨床分期、分化不明確的標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑 顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Bresser公司，DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海一恒科技有限公司，QT-1漩渦混合器購(gòu)自上海琪特分析儀器有限公司，DK-8D型電熱恒溫水槽購(gòu)自上海靜宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，BCD-241WE冷藏冰凍箱購(gòu)自青島海爾公司，2 ml冷存管購(gòu)自美國(guó)IMEC公司，Stratagent Mx3000P熒光定量PCR儀購(gòu)自上海吉泰生物科技有限公司。

PhB4k抗體、EphrinB2多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，SP免疫組化相關(guān)試劑盒購(gòu)自福州邁新公司，高純度梯度酒精購(gòu)自上海化學(xué)試劑有限公司，分析純AR蘇木素購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法 采用SP二步法對(duì)組織樣本進(jìn)行免疫組化染色。玻片厚4 μm，采取脫蠟和梯度酒精對(duì)組織樣本進(jìn)行水化，然后用高壓鍋對(duì)樣本進(jìn)行熱處理5～8 min以對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)和PBS沖洗，使用濃度為3%的過(guò)氧化氫試液對(duì)過(guò)氧化物酶進(jìn)行阻斷，用馬血清進(jìn)行封閉后加用一抗，4℃冰箱孵育樣本過(guò)夜后加生物素標(biāo)記二抗，在室溫下放置30 min后用PBS進(jìn)行充分洗滌，洗滌結(jié)束后加SP復(fù)合物對(duì)樣本孵育20～30 min；用PBS洗3次，每次2 min；用DAB對(duì)樣本進(jìn)行顯色，然后用蘇木素進(jìn)行復(fù)染；最后用自來(lái)水沖洗掉樣本中返藍(lán)，再用梯度酒精脫水，選擇中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，而以陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) EphB4和EphrinB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)均為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿同時(shí)染成黃色或棕褐色，按照著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)，無(wú)著色：0分；淡黃色：1分；棕黃色：2分，褐色：3分。顯微鏡下染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。上述兩項(xiàng)得分相加為最終評(píng)分，-為總分<3分，陰性表達(dá)；+為3分，弱陽(yáng)性表達(dá)；++為4分，中陽(yáng)性表達(dá)；+++為5分，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)[3]。本研究中-為陰性表達(dá)，+、++、+++歸為陽(yáng)性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 EphB4蛋白、EphrinB2蛋白免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá) 病例組EphB4蛋白、EphrinB2蛋白免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)率分別為82.98%(39/47)、76.60%(36/47)，均顯著高于正常組的20.00(2/10)%和10.00%(1/10)(P<0.01)。EphB4蛋白、EphrinB2蛋白在正常視網(wǎng)膜細(xì)胞中可見(jiàn)，均著色為藍(lán)色，無(wú)黃色或棕褐色；EphB4蛋白、EphrinB2蛋白在腫瘤細(xì)胞主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿中，少量位于炎性細(xì)胞的胞漿中，均呈棕褐色表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 EphrinB2、EphB4在正常視網(wǎng)膜細(xì)胞及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)(SP×400)

2.2 不同臨床分期的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本EphB4、EphrinB2蛋白表達(dá)比較 Ⅳ期+Ⅴ期視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本EphB4、EphrinB2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于Ⅰ期+Ⅱ期和Ⅲ期組織標(biāo)本、Ⅲ期顯著高于Ⅰ期+Ⅱ期(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同臨床分期的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本EphB4、EphrinB2蛋白表達(dá)比較

注：與Ⅰ期+Ⅱ期比較,aP<0.05，與Ⅲ期比較,cP<0.05

2.3 不同分化類(lèi)型視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本EphB4、EphrinB2蛋白表達(dá)比較 未分化型視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本EphB4、EphrinB2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞比例均顯著高于分化型組織標(biāo)本(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 不同分化類(lèi)型的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本EphB4、EphrinB2蛋白表達(dá)比較

2.4 視神經(jīng)浸潤(rùn)與否視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本EphB4、EphrinB2蛋白表達(dá)比較 視神經(jīng)浸潤(rùn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本EphB4、EphrinB2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞比例均顯著高于視神經(jīng)未浸潤(rùn)組織標(biāo)本(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 視神經(jīng)浸潤(rùn)與否視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本EphB4、EphrinB2蛋白表達(dá)比較

3 討論

腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程十分復(fù)雜且影響因素較多，腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡失衡是引發(fā)腫瘤形成與發(fā)展的關(guān)鍵性因素。近年來(lái)研究表明EphB4與EphrinB2的信號(hào)通路和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、腫瘤發(fā)展、生理病理性血管形成有著密切關(guān)系[4-6]，Eph受體及其配體成為世界范圍腫瘤研究的熱門(mén)領(lǐng)域。

有研究證明EphB4于胎盤(pán)和一系列原發(fā)癌組織以及惡性細(xì)胞中呈不同程度的表達(dá)[7]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，EphB4在乳腺癌表達(dá)水平呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)[8]；在前列腺癌和黑色素瘤中的表達(dá)具有差異性[9]。EphrinB2在肺、腎、結(jié)腸特別是在肺和結(jié)腸上皮細(xì)胞中呈高度表達(dá)，造成其在肺癌和結(jié)腸癌中表達(dá)水平有1.7～1.9倍的下調(diào)，而其在肝癌和腎癌中表達(dá)水平上調(diào)[10]。有研究者在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在惡性結(jié)腸腫瘤中EphrinB2的表達(dá)水平上調(diào)，而在正常結(jié)腸壁細(xì)胞中其表達(dá)水平很低或?yàn)榱鉡11]。本研究發(fā)現(xiàn)，EphB4與EphrinB2蛋白在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本中陽(yáng)性細(xì)胞比例均明顯高于正常人視網(wǎng)膜組織。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于EphB4與EphrinB2在各種惡性腫瘤中的表達(dá)水平及與臨床因素的關(guān)系存在爭(zhēng)議[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)EphB4在頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中具有較高的表達(dá)水平；癌癥晚期患者和吸煙者的表達(dá)水平均高于早期患者和非吸煙者[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)EphB4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和視網(wǎng)膜母細(xì)胞腫瘤的分化程度及視神經(jīng)浸潤(rùn)程度顯著相關(guān)[14]。本研究得出類(lèi)似結(jié)果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)EphB4與EphrinB2蛋白在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的陽(yáng)性表達(dá)均與臨床分期、分化程度及視神經(jīng)浸潤(rùn)顯著相關(guān)：臨床分期較晚、未分化型、視神經(jīng)浸潤(rùn)者EphB4與EphrinB2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞比例高于臨床分期較早、分化型及視神經(jīng)未浸潤(rùn)者。表明EphB4和EphrinB2與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的產(chǎn)生及發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。因此，EphB4和EphrinB2蛋白可作為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤惡性程度及視神經(jīng)浸潤(rùn)程度的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

有研究表明，EphB4和EphrinB2蛋白的共表達(dá)及它們間的相互作用能夠?qū)σ暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的產(chǎn)生以及發(fā)展起十分重要的作用，并且EphB4在和EphrinB2進(jìn)行配體的過(guò)程中被激活，兩者通過(guò)相互作用在各種組織的發(fā)展、腫瘤發(fā)生及其供血血管生成等方面起著重要的作用[15-16]。EphrinB2在動(dòng)脈血管壁細(xì)胞、血管周?chē)拈g質(zhì)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生特定表達(dá)，而EphB4只在屬于靜脈系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)[17]，同時(shí)EphB4能夠?qū)phrinB2介導(dǎo)細(xì)胞遷移起抑制作用，而EphB4的胞外區(qū)域可以促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤供血血管生成以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，這是因?yàn)槲挥谀[瘤細(xì)胞表面的EphB4與血管上的EphrinB2進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)相互激活從而促進(jìn)腫瘤供血血管的生成和腫瘤的生長(zhǎng)[18-21]。在EPhrinB-EPhB系統(tǒng)的作用下，腫瘤細(xì)胞逐漸生成侵襲性血管，同時(shí)調(diào)整對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的滲透程度，穩(wěn)定新生血管[22]。本研究設(shè)計(jì)存在不足，未對(duì)EphB4和EphrinB2蛋白在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證，有待于在今后的試驗(yàn)中進(jìn)行深入研究。

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Expression and Significance of EphB4 and EphrinB2 Proteins in Retinoblastoma

ZHANG Jian

(Department of Ophthalmology, the People's Hospital Shaanxi Province, Xi'an 710068， China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of EphB4 and EphrinB2 proteins in human retinoblastoma tumor tissues. Methods A total of 10 cases of normal human retinal tissues (normal group) and 47 samples of retinoblastoma tissues (case group) were recruited in this study. Immunohistochemical assay method was used to detect expression levels of EphB4 and EphrinB2 proteins, and the relationship between the expressions and clinicopathological features was analyzed. Results The positive expression rates of EphB4 and EphrinB2 proteins in case group were significantly higher than those in normal group (P<0.01). The positive expressions of EphB4 and EphrinB2 proteins were significantly correlated with clinical stage, differentiation degree and neuro-optic infiltration. Positive cell ratio of EphB4 and EphrinB2 proteins in patients with later clinical stage, undifferentiated type and infiltrative optic nerve type were significantly higher than those in patients with earlier clinical stage, differentiated type and non-infiltrative optic nerve type (P<0.05,P<0.01). Conclusion Expressions of EphB4 and EphrinB2 proteins can be used as forecasting indicators of malignant degree and damage degree of optic nerve in human retinoblastoma tumor tissues.

Retinoblastoma; EphB4 protein; EphrinB2 protein; Gene expression regulation, neoplastic

陜西省科技研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014K11-01-01-23)

710068 西安，陜西省人民醫(yī)院眼科

R739.72

A

2095-140X(2015)08-0025-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.08.007

2015-04-13 修回時(shí)間：2015-05-23)