自然殺傷細(xì)胞及其受體與結(jié)核病研究進(jìn)展

孟祥紅，程小星

自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞是參與機(jī)體固有免疫的重要細(xì)胞。NK細(xì)胞的激活不受主要組織相容復(fù)合物(majar histocompatibility complex，MHC)限制，不依賴抗體，可非特異性地識(shí)別靶細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用破壞溶解靶細(xì)胞、分泌細(xì)胞因子和趨化因子控制病原微生物的感染。NK細(xì)胞同時(shí)也是參與獲得性免疫的重要細(xì)胞［1］，在機(jī)體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用［2］。近年來(lái)隨著對(duì)抗結(jié)核感染固有免疫機(jī)制的深入研究，NK細(xì)胞的重要作用越來(lái)越引起重視?，F(xiàn)將NK細(xì)胞及其受體(NKR)在結(jié)核病中的作用進(jìn)行綜述。

1 結(jié)核分枝桿菌感染與固有免疫

結(jié)核病是引起死亡人數(shù)高居第2位的感染性疾病。由于艾滋病病毒(HIV)的感染流行、耐藥結(jié)核的產(chǎn)生、人口流動(dòng)和免疫抑制劑的應(yīng)用增多等原因，全球結(jié)核病疫情非常嚴(yán)重，僅2012年，全球新發(fā)結(jié)核病例860萬(wàn)，有130萬(wàn)人死亡，約45萬(wàn)人為耐多藥結(jié)核?。?］。我國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核患者約500萬(wàn)，每年約有13萬(wàn)人死于結(jié)核病。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果顯示，目前結(jié)核感染的人數(shù)占世界人口的1/3，結(jié)核病已經(jīng)成為全球重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。盡管受結(jié)核菌感染人數(shù)眾多，僅有5% ～10%的感染者發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核?。?］。研究結(jié)果表明，結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸不僅取決于結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量和毒力，在很大程度上還取決于宿主的免疫狀態(tài)［4-5］。

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mtb)所致的慢性傳染病，Mtb致病性菌體物質(zhì)主要為脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖。脂質(zhì)中的磷脂能夠刺激機(jī)體內(nèi)單核細(xì)胞的增殖并使炎癥中的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)為類上皮細(xì)胞而形成結(jié)核結(jié)節(jié)，蠟質(zhì)D是分枝菌酸和肽糖脂復(fù)合物，具有佐劑活性，參與遲發(fā)型超敏反應(yīng);菌體蛋白可與蠟質(zhì)結(jié)合成為完全抗原，使機(jī)體發(fā)生超敏反應(yīng)。多糖是結(jié)核桿菌菌體完全抗原的主要組成成分，具有佐劑活性，可引發(fā)嗜中性粒細(xì)胞的化學(xué)趨向反應(yīng)。既往普遍認(rèn)為，由于Mtb是胞內(nèi)菌，因此由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抗結(jié)核感染免疫中發(fā)揮核心作用。近年來(lái)的免疫學(xué)和遺傳學(xué)研究結(jié)果表明，固有免疫在結(jié)核免疫中同樣發(fā)揮重要作用，有部分長(zhǎng)期與活動(dòng)性肺結(jié)核患者密切接觸的健康人群結(jié)核菌素(PPD)試驗(yàn)結(jié)果卻為陰性，其原因可能是機(jī)體感染了Mtb后，固有免疫發(fā)揮了重要作用，而細(xì)胞免疫并未啟動(dòng)。近年來(lái)固有免疫在抗結(jié)核感染中的作用已經(jīng)日漸受到關(guān)注。固有免疫和獲得性免疫共同參與抗結(jié)核感染免疫［6］。固有免疫是構(gòu)成機(jī)體抵御病原生物入侵的第一道防線，同時(shí)也是獲得性免疫激發(fā)的基礎(chǔ)。在病原菌入侵宿主的早期，固有免疫系統(tǒng)對(duì)于病原體的控制和清除過(guò)程發(fā)揮著重要作用。固有免疫系統(tǒng)由NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞等及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、白介素(IL)-10、IL-12等細(xì)胞因子和補(bǔ)體蛋白組成。它們無(wú)需抗原預(yù)先致敏，主要通過(guò)釋放穿孔素、脫顆粒酶、表達(dá)配體和分泌干擾素等發(fā)揮作用，殺傷靶細(xì)胞。固有免疫在結(jié)核感染的早期發(fā)揮抗感染作用，而且對(duì)于激發(fā)宿主獲得性免疫也發(fā)揮了重要作用［7-8］。NK細(xì)胞是固有免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，其激活不受MHC限制，不依賴抗體，可快速募集到感染部位，非特異性地識(shí)別被感染的靶細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用破壞溶解靶細(xì)胞，同時(shí)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，NK細(xì)胞也是參與獲得性免疫的重要細(xì)胞，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞抗結(jié)核桿菌的免疫機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

2 NK細(xì)胞表型及在結(jié)核感染中的變化特點(diǎn)

NK細(xì)胞源自骨髓造血干細(xì)胞，成熟NK細(xì)胞主要分布于淋巴器官和血液循環(huán)系統(tǒng)。在人外周血中，NK細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的5% ～20%。NK細(xì)胞表型為 CD3－CD56+，通常依據(jù)細(xì)胞的表面標(biāo)志CD56和CDl6表達(dá)水平不同將NK細(xì)胞分成兩個(gè)亞群:CD56highCD16+/－和 CD56dimCD16+，它們分別具有不同的功能特點(diǎn)。CD56dimCD16+NK細(xì)胞是主要分布于外周血和炎性組織內(nèi)，表達(dá)CXCR1、CX3CR1和ChemR23趨化因子受體，受體表型為 CD16+KIR+/NKG2A+，通常認(rèn)為它具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒作用，基本不分泌細(xì)胞因子。而CD3－CD56highNK細(xì)胞則主要分布在淋巴結(jié)中，受體表型為CD16－KIR－NKG2A+，具有分泌細(xì)胞因子的功能，可分泌IFN-γ、IL-10、IL-13、TNF-α和粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等細(xì)胞因子，可提高巨噬細(xì)胞抑制病原生物增殖的程度和吞噬病原生物的能力，其細(xì)胞毒性作用則不常見［9-10］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在NK細(xì)胞活化的早期，CD3－CD56dimCD16+NK細(xì)胞一方面具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒作用，還可分泌大量的IFN-γ，促進(jìn)單核(巨噬細(xì)胞)系統(tǒng)的活化以及CD8+細(xì)胞增殖和分化，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞毒作用［11-12］。

隨著結(jié)核免疫研究的深入，NK細(xì)胞抗結(jié)核的免疫機(jī)制受到廣泛關(guān)注。目前研究結(jié)果表明，結(jié)核病中NK細(xì)胞的活性受抑，而且發(fā)現(xiàn)在結(jié)核患者中NK細(xì)胞的分布、表型也存在改變，但研究結(jié)果差別很大。Ota等［13］發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者相比，肺結(jié)核患者胸腔積液中NK細(xì)胞的殺傷細(xì)胞活性升高。Nirmala等［14］報(bào)道結(jié)核感染和TB、HIV共感染人群的外周血NK細(xì)胞數(shù)量及相對(duì)比例與健康對(duì)照者比較沒(méi)有明顯區(qū)別，但NK細(xì)胞的活性呈明顯下降。Deveci等［15］在研究中發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者比較，活動(dòng)性肺結(jié)核患者的外周血中CD3－CD16+CD56dimNK細(xì)胞的比例明顯上升。與之結(jié)果相反，Barcelos等［16］報(bào)道肺結(jié)核患者外周血中 CD3－CD16+CD56dimNK細(xì)胞的比例較PPD試驗(yàn)陰性健康對(duì)照者降低，同PPD試驗(yàn)陽(yáng)性的健康對(duì)照者比較則未見明顯差異。Schierloh等［10］發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者胸腔積液中的CD56highNK細(xì)胞比例增加，CD56dimNK細(xì)胞和穿孔素的表達(dá)下降。上述報(bào)道中有關(guān)外周血中NK細(xì)胞數(shù)量、比例分布不一的結(jié)果可能與研究對(duì)象的例數(shù)較少、未排除患者病情、療程及并發(fā)癥等影響免疫功能的因素有關(guān)。結(jié)核病患者中NK細(xì)胞的活性受抑表明其在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮重要作用，但是在結(jié)核感染中NK亞群分布特點(diǎn)及比例還有待進(jìn)一步研究。

3 NK細(xì)胞抗結(jié)核感染機(jī)制

NK細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞毒活性和分泌細(xì)胞因子而發(fā)揮殺傷細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)作用。NK細(xì)胞可非特異性地識(shí)別被病原微生物感染的單核、巨噬細(xì)胞，通過(guò)分泌穿孔素和顆粒酶發(fā)揮細(xì)胞毒作用;同時(shí)通過(guò)分泌大量IFN-γ等細(xì)胞因子及趨化因子的受體、黏附分子受體來(lái)控制病原微生物感染。

抗結(jié)核感染中，NK細(xì)胞可被Mtb特異性抗原誘導(dǎo)活化發(fā)揮殺細(xì)胞作用，其中toll樣受體(toll like receptors，TLR)發(fā)揮了重要作用。TLR是一類跨膜受體，屬于模式分子識(shí)別受體(PRR)，在多種免疫細(xì)胞上表達(dá)，如NK細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、噬堿細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)等，通過(guò)識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的模式分子(PAMP)誘導(dǎo)、活化免疫細(xì)胞，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。當(dāng)機(jī)體感染了Mtb后，TLR識(shí)別Mtb屬細(xì)胞壁成分如PAMP啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)，募集多種固有免疫細(xì)胞到病變部位，不僅發(fā)揮激活固有免疫細(xì)胞、殺傷Mtb的作用，而且在肉芽腫形成和抗結(jié)核感染獲得免疫中發(fā)揮重要作用。目前已知TLR家族中主要有TLR2、TLR4和TLR9參與抗結(jié)核菌感染。在Mtb感染早期，人類NK細(xì)胞通過(guò)TLR2直接識(shí)別 Mtb，分泌 IFN-γ 和 TNF-α，迅速、直接發(fā)揮抗結(jié)核免疫的功能［17］。

NK細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞毒作用和分泌大量可溶性細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α等殺滅被Mtb感染的單個(gè)核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及抑制Mtb在巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖［18］。IFN-γ 可激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生過(guò)氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)等物質(zhì)殺滅寄生在巨噬細(xì)胞內(nèi)的Mtb。NK細(xì)胞被lL-12激活后，培養(yǎng)上清液可明顯抑制 Mtb在巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制［19］。TNF-α還可通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡來(lái)清除胞內(nèi)感染的Mtb，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)對(duì)Mtb的殺傷力。TNF-α與INF-γ協(xié)同作用活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)吞噬溶酶體的形成、成熟及刺激活性氮介質(zhì)產(chǎn)生，共同控制和殺滅Mtb［20］。NK細(xì)胞產(chǎn)生的IL-22通過(guò)增強(qiáng)吞噬溶酶融合而抑制Mtb在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖。Dhiman等［21］發(fā)現(xiàn) IL-22可促進(jìn) NK細(xì)胞產(chǎn)粒溶素增加，殺傷Mtb感染的巨噬細(xì)胞。

4 NKR與抗結(jié)核感染

4.1 NKR分類 NK細(xì)胞通過(guò)抑制型和激活型兩類受體識(shí)別靶細(xì)胞表面的MHC-Ⅰ，通過(guò)傳遞活化或者抑制信號(hào)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。雖然目前發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞表面標(biāo)志很多(表面受體或表面抗原、分子等)，但多為與其他免疫細(xì)胞共有，自身沒(méi)有特異性受體。根據(jù)NKR的功能不同，可分類為活化型受體和抑制型受體;按照受體的配體是否為MHC-Ⅰ類分子，可歸類為MHC-Ⅰ類分子受體和非MHC-Ⅰ類分子受體;根據(jù)受體結(jié)構(gòu)不同可分為:殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)，屬于免疫球蛋白超家族成員(Ig-SF);C型凝集素樣受體(C-type lectin receptor，CLR)，包含1個(gè)或多個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域，主要為CD94/NKG2家族;免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物(immunoglobulin-like transcript，ILT)，該受體家族主要有 ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT7、ILT8 等亞型。KIR家族、CLR和ILT家族中均分別包含活化型和抑制型受體?；罨褪荏w的共同特點(diǎn)是:胞漿區(qū)含有免疫受體酪氨酸活化性基序(immunoreceptortyosine-based activation，ITAM)。抑制型受體的共同點(diǎn)是:受體分子的胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別自身的MHC-Ⅰ類分子，同時(shí)胞漿區(qū)至少含有一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制性基序(immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif，ITIM)。正常情況下，NK細(xì)胞抑制性受體識(shí)別正常細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類分子，向NK細(xì)胞傳遞抑制信號(hào)，抑制NK細(xì)胞保護(hù)正常細(xì)胞不被NK細(xì)胞殺傷。當(dāng)病原體感染靶細(xì)胞后，其細(xì)胞表面的MHC-Ⅰ類分子發(fā)生變化，NKR不能與之結(jié)合，導(dǎo)致NK細(xì)胞活化信號(hào)增強(qiáng)，殺傷被感染的靶細(xì)胞。

4.2 NKR及其抗結(jié)核感染

4.2.1 KIR家族:人類 KIR基因位于染色體19q13．4，目前已知KIR家族共有19個(gè)基因型，主要識(shí)別 HLA-A、HLA-B和 HLA-C分子。KIR2DS1-KIR2DS5、KIR3DS1及 KIR2DL4為活化型受體，KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3為抑制型受體。KIR參與結(jié)核病發(fā)生。Habegger等［22］對(duì)35例結(jié)核患者進(jìn)行HLA分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在結(jié)核患者中KIR2DL3-HLA-C1顯著表達(dá)。NKp46屬于KIR家族的激活性受體，可激活NK細(xì)胞對(duì)多種靶細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞毒作用。Vankayalapati等［23］報(bào)道，在NKp46受體作用下，NK細(xì)胞可裂解結(jié)核菌感染的單核細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞。

4.2.2 CLR:人類CLR多達(dá)60種，主要包括Ly49、CD94/NKG2A和NKG2D等。Ly49分子包括抑制性和激活性受體，其中 Ly49A、B、C、E、F、G、I、Qd 等為抑制性受體，小鼠的 Ly49D、Ly49H、Ly49P、Ly49L 屬于激活性NKR。Ly49分子大部分識(shí)別MHC-Ⅰ類分子，而Ly49H與鼠巨細(xì)胞病毒感染細(xì)胞表面的病毒糖蛋白m157具有高親和力。NKG2A與CD94結(jié)合形成異二聚體，在NK細(xì)胞表面表達(dá)為抑制性受體，可負(fù)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能，促使巨噬細(xì)胞逃逸NK細(xì)胞介導(dǎo)固有免疫。NKG2D屬于激活性受體，可與HLA-A和HLA-B類分子及部分U16蛋白結(jié)合，激活NK細(xì)胞，殺傷結(jié)核菌感染的靶細(xì)胞。

4.2.3 ILT:ILT屬于免疫球蛋白超家族一員，是新發(fā)現(xiàn)的一類HLA-Ⅰ類受體家族，又稱白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(leucocyte Ig-like receptor，LIR)或者CD85。人類 ILT 位于人染色體 19q13．2 ～13．4，按照功能將ILT分為抑制性(主要為ILT2、ILT3、ILT4、ILT5等)受體和激活性受體(主要為 ILT1、ILT7、ILT8等)兩類，既有負(fù)性調(diào)節(jié)又有正性調(diào)節(jié)作用。ILT與KIR具有親緣性，ILT表達(dá)則更為廣泛，可在T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)各不相同的受體類型，通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性或激活性信號(hào)發(fā)揮廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。

ILT2(又稱 CD85j、LILRB1、LIR-1)作為 ILT 家族中的重要成員，屬于免疫球蛋白超家族1型跨膜受體蛋白，分子量為110 kD，胞質(zhì)內(nèi)含有4個(gè)ITIMs，屬于抑制性受體，該受體通過(guò)動(dòng)員Src同源結(jié)構(gòu)域(SH2)蛋白如SHP參與ITIMs酪氨酸磷酸化的負(fù)信號(hào)調(diào)節(jié)［24］。ILT2能結(jié)合經(jīng)典及非經(jīng)典的HLA分子，包括 HLA-A、-B、-C、-E 和-G，同時(shí)，ILT-2 還能識(shí)別病毒蛋白如與人類CMV(HCMC)編碼MHC-Ⅰ類分子的同源分子UL18蛋白以抑制效應(yīng)細(xì)胞的活性［25］，在 T細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上廣泛表達(dá)。ILT2受體與抗體發(fā)生交聯(lián)可激發(fā)抑制信號(hào)，減低CD8 T細(xì)胞的細(xì)胞毒活，阻斷ILT2信號(hào)通路可加強(qiáng)CTL細(xì)胞的溶細(xì)胞作用［26］。ILT2抑制T細(xì)胞的功能是通過(guò)抑制TCR和T細(xì)胞活化銜接因子(linker for activation of T cells，LAT)磷酸化和抑制肌動(dòng)蛋白細(xì)胞重排實(shí)現(xiàn)的。另一方面，據(jù)相關(guān)報(bào)道，CD8+T細(xì)胞上的ILT2可與人類巨細(xì)胞病毒HCMC的蛋白UL18發(fā)生特異性反應(yīng)，介導(dǎo)非 MHC限制的 HCMC感染細(xì)胞的裂解［27-28］。Scott Algara等［29］發(fā)現(xiàn)ILT2+NK細(xì)胞可有效地控制HIV-1在單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞(MDDCs)中的復(fù)制。Arnold等［30］發(fā)現(xiàn) ILT2可與非 HLA-I型配體-S100蛋白家族中的一種鈣結(jié)合蛋白S100A9相互作用，增強(qiáng)NK細(xì)胞抗HIV-1感染的活性。

ILT2作為一種免疫抑制分子，在抗病毒、抗腫瘤、自身免疫性疾病和器官移植耐受領(lǐng)域已經(jīng)有相關(guān)研究，但對(duì)于ILT2在結(jié)核免疫中的作用研究很少。有學(xué)者對(duì)艾滋病(結(jié)核病)患者NK細(xì)胞上ILT2的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)研究，并與健康對(duì)照組比較，在艾滋病和艾滋病合并結(jié)核感染患者中，ILT2在CD3－CD56+NK細(xì)胞上表達(dá)水平升高，但在CD3－CD16+NK細(xì)胞表達(dá)上無(wú)差別;而在單獨(dú)肺結(jié)核感染患者中，ILT2在兩種NK細(xì)胞亞型細(xì)胞上的表達(dá)均降低，由于研究對(duì)象例數(shù)過(guò)少，并未進(jìn)行ILT2的功能研究［31］。筆者所在課題組對(duì)70例活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血NK細(xì)胞上ILT2的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ILT2在活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血 CD56dimCD16+NK細(xì)胞表達(dá)比例明顯高于健康對(duì)照者，且表達(dá)水平與肺結(jié)核病的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān);對(duì)ILT2的功能研究發(fā)現(xiàn)，ILT2在CD56dimNK細(xì)胞的表達(dá)與NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用缺陷和產(chǎn)生IFN-γ降低相關(guān)，通過(guò)阻斷ILT2信號(hào)通路可提高CD56dimNK細(xì)胞的細(xì)胞毒作，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)ILT2可促進(jìn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者CD56dimNK細(xì)胞的自然凋亡［32］。

5 結(jié)語(yǔ)

NK細(xì)胞及NKR在抗結(jié)核固有免疫中顯示出重要作用。NK細(xì)胞及不同亞群表達(dá)一系列激活或抑制性受體，兩種受體之間的平衡是調(diào)控NK細(xì)胞是否被激活發(fā)揮抗感染免疫功能的重要機(jī)制。ITL2作為新發(fā)現(xiàn)的一類的 NK細(xì)胞抑制性受體，在CD56dimNK細(xì)胞上的表達(dá)水平與肺結(jié)核病的病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可通過(guò)下調(diào)肺結(jié)核患者CD56dimNK細(xì)胞的功能及促進(jìn)CD56dimNK細(xì)胞的自然凋亡而參與結(jié)核免疫。進(jìn)一步研究NK細(xì)胞在結(jié)核病中的變化及機(jī)制，設(shè)計(jì)與之相關(guān)的拮抗劑，將為結(jié)核病的防治提供新思路。

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