豬干擾素α質(zhì)粒-PLL聚合體對豬PRRSV弱毒疫苗免疫增強(qiáng)作用研究

楊竹鳴，陳善真，李其昌，劉小琴，王貴平，范紅結(jié)，李中圣

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東 廣州510630；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京210095）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起的一種惡性傳染病，該病發(fā)病率高、傳播快，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。PRRSV感染機(jī)體引起的免疫抑制和持續(xù)性感染一直是PRRS防控的難點。目前，PRRS主要的預(yù)防手段仍然是注射疫苗，無論是PRRSV滅活苗還是弱毒疫苗，不能刺激體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的清除病毒的免疫反應(yīng)，只能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度中和抗體限制PRRSV的繼續(xù)感染。細(xì)胞因子具有免疫佐劑效應(yīng)，諸多研究表明，細(xì)胞因子可在不同程度上增加滅活苗、弱毒苗、亞單位疫苗，以及核酸疫苗的免疫效應(yīng)[1]。IFNα屬于Ⅰ型干擾素，主要是通過對Th1細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)和對MHC I類分子的誘導(dǎo)表達(dá)起調(diào)節(jié)作用[7]。由于PRRSV具有免疫抑制的病毒感染機(jī)制，在PRRSV免疫中，配合可提高機(jī)體T淋巴細(xì)胞分化作用的細(xì)胞因子佐劑可明顯改善疫苗免疫效力[3-8]。豬IFNα（PIFNα）在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用研究證明，肌肉注射PIFNα表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒被肌肉細(xì)胞攝取后，重組蛋白的分泌表達(dá)效率極低。為使質(zhì)粒DNA在體內(nèi)高效表達(dá)，學(xué)者們已做了許多關(guān)于免疫途徑研究，通過基因槍注射質(zhì)?；蛘邔①|(zhì)粒注射到淋巴結(jié)中來提高質(zhì)粒在體內(nèi)的表達(dá)效率，但是仍然沒有很好的解決提高質(zhì)粒在體內(nèi)表達(dá)效率的問題。本試驗首先將重組質(zhì)粒pVAX1-PIFNα與一種陽離子多聚體-PLL聚合為：PLL-pVAX1-PIFNα，然后利用PLL-pVAX1-IFNα聯(lián)合PRRSV弱毒疫苗對豬進(jìn)行免疫，通過檢測PRRSV中和抗體水平評估重組PIFNα對PRRSV弱毒疫苗的增強(qiáng)作用；通過細(xì)胞試驗，驗證了質(zhì)粒復(fù)合物對豬外周血淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達(dá)重組質(zhì)粒：pVAX1-PIFNα，由我實驗室構(gòu)建保存；陽離子多聚體：PLL（多聚賴氨酸），為Sigma公司產(chǎn)品。8周齡長白豬，經(jīng)ELISA檢測PRRSV抗體陰性。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗JXA1-R株（20頭份），廣東某疫苗公司產(chǎn)品。豬IFN-γ檢測試劑盒，購自上?？婆d商貿(mào)有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）中和抗體ELISA檢測試劑盒，為法國LSI專業(yè)診斷試劑。

1.2 pVAX1-PIFNα質(zhì)粒與PLL的聚合 方法：1 mL的濃度為969.1 ng/μL的pVAX1-PIFNα質(zhì)粒與1mL的濃度為1 ng/μL的PLL混合備用，即1.938 μg的pVAX1-PIFNα質(zhì)粒與0.4μg的PLL混合，凝膠電泳法驗證復(fù)合效果。

1.3 細(xì)胞試驗 60日齡健康豬，前腔靜脈采血50mL，抗凝處理，抗凝血中加入紅細(xì)胞裂解液冰浴中裂解，棄掉上清，加入高壓滅菌的PBS清洗細(xì)胞3次，最終用12 mL 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。細(xì)胞稀釋后加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×106/well。

按照Lipofectamine 2000使用說明分別做以下3組轉(zhuǎn)染試驗。A組：PLL-pVAX1-PIFNα；B組：pVAX1-PIFNα；C組：pVAX1空白質(zhì)粒（陰性對照），每組4個重復(fù)，置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，分別在12、24、48 h取細(xì)胞培養(yǎng)液，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中PIFN-γ的表達(dá)水平。

1.4 動物免疫 挑選20頭30日齡RRSSV抗體陰性豬，分為4組，每組5頭。如表1，1-3組設(shè)置為免疫組，第4組注射生理鹽水，作為空白對照組，注射后各組隔離養(yǎng)殖。免疫用PRRSV疫苗為：PRRSV JXA1-R株弱毒苗。所有試驗豬均采取耳后頸部注射。

表1 分組情況

分別在免疫前、免疫后第8、16、24、31、44天于豬前腔靜脈采血，分離血清，用法國ELISA檢測試劑盒檢測PRRSV中和抗體。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞試驗中IFN-γ的檢測 經(jīng)ELISA法檢測，檢測到在細(xì)胞試驗第12、24、48小時，加PLLpVAX1-PIFNα的A組檢測到的IFN-γ的量均顯著高于加pVAX1-PIFNα的B組（P＜0.05），對照組的中和抗體水平未見明顯變化（如圖1）。

圖1 T細(xì)胞分泌的IFN-γ的檢測

2.2 免疫豬的中和抗體水平的檢測 本試驗中（如圖2），經(jīng)檢測，疫苗免疫后第8天尚未產(chǎn)生PRRSV中和抗體，在免疫后第16天中和抗體開始升高。在免疫檢測的44 d內(nèi)，PLL-pVAX1-PIFNα注射組的抗體水平顯著高于其他3組（P＜0.05）；pVAX1-PIFNα注射組的中和抗體水平與只注射PRRSV弱毒苗組的水平相當(dāng)，說明pVAX1-PIFNα質(zhì)粒未明顯提高免疫水平；對照組的中和抗體水平未見明顯變化。

3 討論

圖2 PLL對機(jī)體免疫反應(yīng)的作用

近幾年，對PRRSV的研究在分子生物學(xué)方面取得了顯著進(jìn)展，對其感染機(jī)體引起的免疫抑制和持續(xù)性感染的分子機(jī)制也有了進(jìn)一步認(rèn)識。PRRSV感染引起的免疫抑制和持續(xù)性感染的主要原因非常復(fù)雜。一方面，豬感染PRRSV野毒株或機(jī)體免疫弱毒疫苗，不能刺激體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的清除病毒的免疫反應(yīng)，雖然PRRSV感染后N蛋白和M蛋白能夠較早誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，但是這兩種早期產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)外均不能有效中和PRRSV，疫苗免疫后期出現(xiàn)的高水平中和抗體無法清除免疫系統(tǒng)內(nèi)部的病毒粒子。另一方面，PRRSV的病毒感染機(jī)制有效降低了體內(nèi)T細(xì)胞對病毒的防御作用。研究發(fā)現(xiàn)，分泌IFN-γ的PRRSV特異性T細(xì)胞和高滴度中和抗體是介導(dǎo)強(qiáng)烈的殺傷病毒免疫反應(yīng)的主要因素[2]。IFNα一方面具有啟動細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白大量表達(dá)的級聯(lián)反應(yīng)機(jī)制，同時也可通過對Th1細(xì)胞的調(diào)節(jié)促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞分泌IFN-γ，進(jìn)一步介導(dǎo)機(jī)體對病毒的清除作用。PRRSV不同于其他病毒，感染豬后會抑制體內(nèi)IFNα的產(chǎn)生。對于豬IFNα的應(yīng)用，已有很多報道，豬干擾素α蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)中得到表達(dá)，其細(xì)胞免疫激活功能也得到驗證[8-10]。然而，普遍的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白形式的豬IFNα存在半衰期短、易被降解、蛋白純化成本較高等一系列問題，為此，本文嘗試直接利用PIFNα真核表達(dá)質(zhì)粒配合疫苗免疫，以提高PRRSV疫苗免疫過程中的T細(xì)胞免疫水平。

本試驗將pVAX1-PIFNα重組質(zhì)粒與多聚賴氨酸（PLL）聚合，聯(lián)合PRRSV弱毒疫苗免疫試驗豬，探討聚合體形式的豬IFNα對PRRSV疫苗免疫增強(qiáng)作用。PLL是一種極性較強(qiáng)的大分子物質(zhì)，作為一種陽離子多聚物被廣泛用來凝結(jié)DNA質(zhì)粒，凝結(jié)為微粒狀和短棒狀的聚合物可以被細(xì)胞通過非特異性的和細(xì)胞受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[11-12]。本試驗利用PLL載體的聚合作用，將pVAX1-PIFNα質(zhì)粒凝結(jié)為聚合物PLL-pVAX1-PIFNα。聚合體狀態(tài)的PLL-pVAX1-PIFNα可降低質(zhì)粒在機(jī)體內(nèi)降解的進(jìn)程，延長其對免疫細(xì)胞的刺激時間[13-14]。近年來，非病毒載體這一技術(shù)被廣泛用于醫(yī)學(xué)上腫瘤的基因治療中[15-16]，學(xué)者們在多聚物基因載體上加上具有細(xì)胞靶向性的基團(tuán)，以實現(xiàn)質(zhì)粒DNA在指定的某類細(xì)胞中表達(dá)[17]。如果將這一技術(shù)應(yīng)用到動物疾病的治療中，將為動物醫(yī)學(xué)的發(fā)展做出巨大的貢獻(xiàn)。

研究報道，在PRRSV感染初期，在豬體內(nèi)注射含豬IFNα的非復(fù)制性腺病毒載體DNA，發(fā)現(xiàn)外源IFNα的增加推遲了病毒血癥的出現(xiàn)，降低了血液中病毒的滴度[18]，說明在PRRSV感染期，外源IFNα可以增強(qiáng)機(jī)體對PRRSV的天然免疫和獲得性免疫。在本文的細(xì)胞試驗中，分別應(yīng)用pVAX1-PIFNα和PLL-pVAX1-PIFNα刺激豬淋巴細(xì)胞，IFNα可直接刺激IFN-γ等Th1細(xì)胞因子的激活，進(jìn)而調(diào)動免疫細(xì)胞的抗原呈遞作用和免疫系統(tǒng)對病毒的清除作用。聚合體狀態(tài)的PLL-pVAX1-PIFNα可以更為有效地刺激淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，其原因一方面可能在于聚合體質(zhì)粒不易降解，延長了質(zhì)粒對細(xì)胞的作用時間；另一方面，PLL可能促進(jìn)了轉(zhuǎn)染試劑的效率，從而提高了細(xì)胞對質(zhì)粒的攝取作用。與單純的質(zhì)粒相比，聚合體狀態(tài)的PLL-pVAX1-PIFNα有效提高了PRRSV疫苗的免疫效力，這與IFNα對機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的早期激活及病毒粒子的及時清除有密切關(guān)系。作者根據(jù)PRRSV活疫苗免疫現(xiàn)狀，嘗試一種在獲得性免疫激活的同時加強(qiáng)機(jī)體先天免疫的方法，為獸用干擾素的臨床應(yīng)用提供了有益參考，也為功能質(zhì)粒的臨床應(yīng)用提供了有力借鑒。

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