表達(dá)ILTV gB和UL32基因的重組雞痘病毒疫苗安全性及穩(wěn)定性分析

徐美玉，趙 燁，朱發(fā)江，張圓圓，，趙紅玲，秦秀慧，張國中

[1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193；2.北京市畜牧總站，北京 朝陽100107；3.詩華諾康科技發(fā)展（北京）有限公司，北京 朝陽100016]

雞傳染性喉氣管炎（ILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）引起雞的一種急性上呼吸道傳染病，為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。疫苗接種是防制本病的最好方法。ILTV滅活疫苗制備和運輸成本高，一般不用于實際生產(chǎn)。弱毒疫苗具有相對較好的免疫效果，但安全性較差，會伴隨一系列副作用[1-2]?；蚬こ桃呙?，尤其是重組病毒載體疫苗的安全性好、毒副作用小等優(yōu)點使其成為ILTV的疫苗研究的一個熱點。

表達(dá)ILTV gB和UL32基因的重組雞痘病毒疫苗以雞痘病毒作為載體，表達(dá)ILTV gB基因和UL32基因，經(jīng)冷凍干燥制成。UL32蛋白是包裝糖蛋白，而gB蛋白是病毒感染所必需的主要免疫糖蛋白。gB基因和UL32基因的保守性都很高，gB基因是ILTV的主要的保護(hù)性抗原[3-4]。雞痘病毒作為較成熟的重組病毒疫苗載體，已成功用于多種病原保護(hù)性抗原的表達(dá)，并在接種機體后顯示出良好的免疫原性。

為了評估表達(dá)ILTV gB和UL32基因的重組雞痘病毒活疫苗Vectormune FP-LT的安全性與穩(wěn)定性，我們通過一系列試驗對影響疫苗病毒的安全性與穩(wěn)定性的指標(biāo)進(jìn)行了評估，為該載體疫苗的生產(chǎn)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 疫苗、毒株和實驗動物 表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gB和UL32基因的重組雞痘病毒活疫苗（FP-LT）由美國詩華-百妙動物保健公司生產(chǎn)（批號為420-046）。雞痘強毒102株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；9～10日齡SPF雞胚和6～8周齡SPF雞，購自北京維通利華實驗動物有限公司；ILTV抗體檢測用試劑盒為BioChek產(chǎn)品，購自北京天之泰生物科技有限公司。

1.2 檢測引物 根據(jù)已發(fā)表傳染性喉氣管炎病毒UL32基因序列及雞痘病毒4b核心蛋白基因序列分別設(shè)計特異性引物，如表1所示。

表1 本研究PCR檢測用引物

1.3 雞痘強毒102株EID50的測定 雞痘強毒102株通過SPF雞胚絨毛尿囊膜傳代復(fù)壯，復(fù)壯病毒進(jìn)行10-1～10-5稀釋分別接種10日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜，每一稀釋度接種5枚，接種后120 h觀察并統(tǒng)計記錄絨毛尿囊膜變化（水腫、出現(xiàn)明顯痘斑）情況，根據(jù)Reed-Muench法計算毒株EID50。

1.4 疫苗株的傳代 將6～8周齡SPF雞通過右側(cè)股腿部外側(cè)涂抹毛囊接種疫苗，每只0.03mL。接種后5 d，隨機選取2只接種部位痘腫皮膚，研磨后用含抗生素（青霉素、鏈霉素各1 000單位（μg/mL）的PBS制成10%乳劑，離心取上清0.03 mL，以同樣方法接種第2代雞，如此連續(xù)傳至第5代。每代疫苗接種后，每日觀察接種雞的臨床癥狀，直至接種后14 d。觀察完畢，將第2、3、4代雞做安樂死處理，對每代2只取樣的傳代雞進(jìn)行剖檢觀察。第1代疫苗接種后定期撲殺取接種部位皮膚、氣管、肝臟、脾臟、腔上囊和腦，利用PCR方法檢測重組病毒存在情況。取第5代重組病毒利用PCR檢測ILTV UL32基因的變異情況。

1.5 攻毒試驗 第5代雞接種后14 d，對第1代、第5代接種雞以及同居雞通過左側(cè)股腿部毛囊涂抹方式攻擊雞痘強毒102株，攻毒劑量為103EID50/只。同時設(shè)立空白對照雞和攻毒對照雞（與第5代同日齡），攻毒后每日觀察記錄攻擊部位的反應(yīng)，直至攻毒后21 d。

1.6 接種雞排毒情況和飼養(yǎng)環(huán)境中病毒的存在情況檢測 第1代雞疫苗接種后定期采集試驗組和對照組雞的泄殖腔拭子，在7 d和14 d采集環(huán)境中的糞便以及籠具內(nèi)表面擦拭物進(jìn)行重組雞痘病毒的分離，并采用PCR方法檢測FPV-4b基因的存在情況。

2 結(jié)果

2.1 雞痘強毒102株EID50的測定 將雞痘強毒102株經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種SPF雞胚進(jìn)行復(fù)壯，并測定復(fù)壯病毒的EID50為10-3.32/0.15mL，結(jié)果如表2所示。

表2 雞痘102株EID50測定結(jié)果

2.2 重組疫苗的安全性檢測 試驗雞接種每代疫苗后，均觀察到接種部位的正常疫苗反應(yīng)（“痘發(fā)”），“痘發(fā)”從疫苗接種3 d出現(xiàn)，9 d開始逐漸恢復(fù)，至14 d完全恢復(fù)正常，此外未見其他臨床癥狀。對每代雞進(jìn)行剖檢觀察，亦未見任何病理變化。各代接種雞接種部位“痘發(fā)”表現(xiàn)類似，第1代雞疫苗接種部位的觀察記錄結(jié)果如圖1所示。

2.3 重組病毒的穩(wěn)定性 FP-LT疫苗經(jīng)SPF雞連續(xù)傳代，除疫苗接種部位皮膚的正常反應(yīng)外，各組傳代雞均未見任何異常表現(xiàn)，第5代傳代疫苗毒中ILTV UL32基因序列與原代相比未發(fā)生任何變異，表明疫苗具有良好的遺傳穩(wěn)定性。利用SPF雞胚測定不同代次毒株的毒價，結(jié)果表明，各代次毒株毒價穩(wěn)定，無毒力返強現(xiàn)象，結(jié)果如表3所示。

2.4 重組病毒在雞體內(nèi)的分布及存留時間 PCR檢測結(jié)果表明，接種后疫苗毒主要分布在接種部位皮膚，至少在接種后14 d仍可從部分雞接種部位皮膚檢出，其他組織如肝臟、腦、氣管等未有病毒檢出，如表4所示。

圖1 第1代雞接種部位皮膚表現(xiàn)

表3 重組雞痘病毒FP-LT不同代次毒株毒價檢測

表4 重組病毒在雞體內(nèi)的分布情況及存留時間

2.5 重組疫苗的攻毒保護(hù)情況 臨床觀察及PCR檢測結(jié)果表明，重組疫苗免疫雞對雞痘強毒102株攻擊具有較好的保護(hù)力，保護(hù)率均在90%以上（表5），而同居雞攻毒后沒有任何保護(hù)力，同居雞攻毒部位皮膚重組雞痘病毒PCR檢測結(jié)果如圖2所示。

表5 重組疫苗對雞痘的攻毒保護(hù)結(jié)果

2.6 免疫雞排毒及重組病毒在環(huán)境中的存活時間PCR和病毒分離結(jié)果表明，疫苗接種后3～5 d部分雞只存在短暫排毒現(xiàn)象，但環(huán)境監(jiān)測表明，病毒在環(huán)境中存在時間極短，如表6所示。同居雞攻毒試驗、環(huán)境中重組病毒檢測結(jié)果表明，重組病毒不具備水平傳播能力。

表6 重組疫苗免疫雞排毒情況檢測

圖2 對照雞攻毒部位皮膚雞痘病毒PCR檢測結(jié)果

3 討論

禽痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是繼痘苗病毒以后的又一種動物病毒表達(dá)系統(tǒng)。與痘苗病毒不同，禽痘病毒的宿主范圍很窄，對人和其他哺乳動物僅產(chǎn)生一過性感染，接種副作用小。目前，研究者已經(jīng)構(gòu)建了表達(dá)多種禽類傳染病病毒蛋白的重組禽痘病毒，其中以禽痘病毒作為載體表達(dá)NDV HN基因和F基因及H5亞型AIV的重組活載體疫苗已獲得美國農(nóng)業(yè)部的生產(chǎn)許可證[5]。重組痘病毒在ILTV疫苗研制方面也受到了人們的普遍關(guān)注。作為基因工程活載體疫苗研制中應(yīng)用極為廣泛的一種工具，雞痘病毒具有如下優(yōu)點：（1）能針對外源基因產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞毒T細(xì)胞免疫應(yīng)答，一次接種可以產(chǎn)生長時間的免疫力；（2）因為重組疫苗只含有病原微生物特定的抗原成分，動物免疫后可以將自然感染動物與免疫動物區(qū)分開來；（3）雞痘病毒很容易在雞胚成纖維細(xì)胞和雞胚皮膚細(xì)胞等一些禽源細(xì)胞系上增殖，生產(chǎn)成本低廉；（4）痘病毒對熱穩(wěn)定．易于保藏和運輸，不需要佐劑，不需要純化[6]。

本研究對表達(dá)ILTV gB和UL32基因的重組雞痘病毒活疫苗的安全性和穩(wěn)定性進(jìn)行了評估。結(jié)果表明，重組雞痘病毒疫苗經(jīng)SPF雞多次傳代后外源基因序列無任何變異，各代次毒株毒價穩(wěn)定，無毒力返強現(xiàn)象，表明該疫苗具有良好的遺傳穩(wěn)定性。對試驗雞進(jìn)行攻毒，重組病毒免疫雞能抵抗雞痘強毒102株攻擊，表明該疫苗具有較好的保護(hù)力。對接種雞體內(nèi)及環(huán)境中重組病毒檢測結(jié)果顯示，病毒在接種雞體內(nèi)各臟器及環(huán)境中存在時間極短，且同居雞未被感染，表明重組病毒不具有水平傳播能力，不會對環(huán)境造成污染，表明該疫苗具有良好的安全性。本研究對影響疫苗病毒的安全性與穩(wěn)定性的指標(biāo)進(jìn)行了評估，為該載體疫苗在養(yǎng)禽生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[3]鄭海洲，楊虹，柏桂寧，等.雞傳染性喉氣管炎病毒基因的克隆及其在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)[J].微生物學(xué)報，2004，44（6）：830-833.

[4]張紹杰，倪健強，孟松樹，等.傳染性喉氣管炎病毒王崗株糖蛋白基因在重組桿狀病毒中的表達(dá)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2001，23（5）：321-324.

[5]張紹杰，孟松樹，仇華吉，等.雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）王崗株糖蛋白gB基因序列比較分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2000，20（6）：544-547．

[6]陳萬平，程安春，江銘書，等.皰疹病毒UL32基因及其編碼蛋白研究進(jìn)展[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物微生態(tài)學(xué)分會第四屆第九次學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）.

[7]Su B S，Shen PC，Hung L H，et al.Potentiation of cell-mediated immune responses against recombinant HN protein of Newcastle disease virus by recombinant chicken IL-18[J].Vet Immunol Immunopathol，2011，141（3-4）：283-292.

[8]王云峰，智海東，王玫，等.表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒gB基因重組雞痘病毒疫苗免疫持續(xù)期試驗[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2004，26（2）：131-135.