羊黑疫單價(jià)疫苗的研制及免疫家兔血清抗體測定

張西云，李生慶，李志寧，范玉霞，尼 瑪，何生德，黃 榮，胡國元，王亭亭，劉懷新，祁 果

（1.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧810016；2.青海省海晏縣獸醫(yī)站，青海 海晏812200；3.青海省海晏縣青海湖鄉(xiāng)獸醫(yī)站，青海 海晏812200）

羊黑疫又稱傳染壞死性肝炎，羊的一種急性 高度致死性毒血癥，特征是肝實(shí)質(zhì)壞死病灶，綿羊、山羊均可發(fā)生。2006年以來，在海北地區(qū)多個(gè)縣發(fā)生羊急性死亡，2008年9月青海省海晏縣甘子河鄉(xiāng)尕海村牧戶扎西飼養(yǎng)的羊群發(fā)生急性死亡，飼養(yǎng)300余只，陸續(xù)死亡40余只；2008年11月份，海晏縣三角城鎮(zhèn)李×購入1～1.5歲公母羊300余只育肥，購入后該羊群注射羊四聯(lián)苗。1個(gè)月后羊群中出現(xiàn)急性死亡的羊只，到元月份綿羊出售前共死亡羊60余只；2010年9月底，青海湖鄉(xiāng)同寶村東周才郎飼養(yǎng)綿羊700余只，到12月止陸續(xù)死亡成年綿羊100余只，至2011年5月份仍然有零星死亡，主要以成年母羊?yàn)橹?，最終死亡160余只。上述羊群均已注射羊黑疫疫苗。鑒于上述情況，試驗(yàn)利用本室保存的羊黑疫菌株，結(jié)合C61-4標(biāo)準(zhǔn)菌株，進(jìn)行了羊黑疫單價(jià)疫苗的研制及家兔免疫試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 菌株 B型諾維梭菌制苗菌株C61-4，地方分離株TB05。

1.2 培養(yǎng)基制備 基礎(chǔ)液為肉肝胃酶消化液（本實(shí)驗(yàn)室自制），VF培養(yǎng)基（1.0%?胨、0.5%酵母浸膏、1.0%葡萄糖、調(diào)pH值到8.4，分裝后上覆石蠟油，115℃，40min高壓滅菌后待用）。

1.3 疫苗制備

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)

1.3.1.1 種子培養(yǎng) 將C61-4菌株和TB05株分別接種于未加生肝的VF培養(yǎng)基中，37℃溫箱中培養(yǎng)72 h后取出待用。

1.3.1.2 大瓶培養(yǎng) 將上述種子按5%的比例接種至高壓滅菌后的培養(yǎng)基中，37℃溫箱中培養(yǎng)72 h。分別吸取分離株氫氧化鋁苗和C61-4磷酸鋁苗5mL，4 000 r/min離心20min，按比例稀釋后靜脈注射體重18～20 g小鼠，觀察小鼠死亡情況。

1.3.2 菌苗制備

1.3.2.1 菌液脫毒、殺菌 菌液培養(yǎng)72 h，按0.5%的劑量加入甲醛，密閉（之前應(yīng)充分振蕩，并注意排氣），置于37℃殺菌、脫毒72 h，每天充分搖振2次。

1.3.2.2 無菌檢驗(yàn) 分別吸取分離株培養(yǎng)液和C61-4分離株培養(yǎng)液接種至加生肝的VF培養(yǎng)基、普通肉湯、普通斜面各兩支，每支接0.5mL，37℃溫箱中培養(yǎng)1周，觀察有無雜菌。

1.3.2.3 脫毒檢驗(yàn) 72 h后分別吸取分離株培養(yǎng)液和C61-4株培養(yǎng)液5 mL，4 000 r/min離心20 min，原液靜脈注射體重18～20 g小鼠0.2mL，觀察小鼠死亡情況。

1.3.2.4 菌苗配制 將脫毒菌液用銅紗網(wǎng)濾吸至分別加有2 000mL氫氧化鋁膠、磷酸鋁膠及明礬佐劑溶液瓶中至10 000mL刻度，即菌液4份+鋁膠1份，每毫升菌苗含氫氧化鋁7mg，按0.01%的量加入1%硫柳汞100mL，充分混合后，分裝。

1.3.3 菌苗無菌、安全性檢驗(yàn)

1.3.3.1 無菌檢驗(yàn) 菌苗分別接種普通斜面、普通肉湯、厭氣肝湯各兩管，每管接種0.5mL。另用100mL肉湯和100mL厭氣肝湯各1瓶，分別接種菌苗0.5mL，培養(yǎng)7 d后，分別自肉湯瓶和厭氣肝湯瓶吸取適量培養(yǎng)物，移植于普通斜面和普通肉湯各1支，37℃共培養(yǎng)14 d，觀察有無細(xì)菌生長。

1.3.3.2 安全性檢驗(yàn) 取體重1.5～2 kg健康兔4只，TB05株氫氧化鋁苗和C61-4磷酸鋁苗分別肌肉注射疫苗5 mL，觀察有無局部或全身異常反應(yīng)，連續(xù)觀察4周。

1.3.4 家兔免疫試驗(yàn) 取體重1.5～2 kg健康兔44只，按菌株和賦形劑不同分為分離株氫氧化鋁苗、磷酸鋁苗和明礬苗，C61-4磷酸鋁苗，免疫劑量分為0.1mL和0.5mL，每1免疫劑量皮下注射家兔4只，對照組各2只。免疫21 d后，按家兔最小致死量300 MLD/mL攻毒。觀察記錄家兔死亡情況。

1.3.5 血清抗體效價(jià)測定

1.3.5.1 血清采集 上述免疫家兔免疫21 d后，耳中動(dòng)脈采血，在4℃冰箱過夜，待血清析出后，按組別吸出血清待用。

1.3.5.2 中和毒素制備 將培養(yǎng)液500 mL 5 000 r/min離心20 min，上清用正壓濾器過濾除菌，用體重18～20 g小鼠靜脈注射測定毒價(jià)。

1.3.5.3 中和試驗(yàn) 將上述毒素抗原遞倍稀釋到相應(yīng)滴度，不同毒素含量分配到不同的稀釋管中，每管加入血清0.1mL，37℃作用50min后，吸0.2mL給小鼠靜脈注射，觀察、記錄死亡情況。

2 結(jié)論

2.1 菌液培養(yǎng)毒素測定 分離株培養(yǎng)液經(jīng)離心18～20 g小鼠靜脈測毒，其毒力為2萬MLD/mL，C61-4標(biāo)準(zhǔn)菌株毒力為1.5萬MLD/mL。

2.2 菌液殺菌、脫毒 用0.5%甲醛溶液37℃72 h即可殺菌、脫毒徹底。

2.3 菌苗安全性試驗(yàn) 分離株氫氧化鋁苗和C61-4磷酸鋁苗分別肌肉注射疫苗5mL，連續(xù)觀察4周，局部或全身均無異常反應(yīng)，安全性良好。

2.4 效力檢驗(yàn)

2.4.1 不同菌株、不同免疫劑量家兔免疫效果試驗(yàn) 對照兔，靜脈注射300MLD毒素，2/2死亡，即1個(gè)家兔MLD=300小鼠MLD。TB05株磷酸鋁苗0.5mL免疫組最高可抵抗200個(gè)MLD（家兔最小致死量），而C61-4磷酸鋁苗最高只能抵抗100個(gè)MLD；分離株磷酸鋁苗0.1mL免疫組最高可抵抗200個(gè)MLD，而C61-4株最高只能抵抗低50個(gè)MLD（結(jié)果見表1和圖1）。

表1 不同菌株、不同賦形劑羊黑疫單價(jià)苗家兔免疫攻毒試驗(yàn)

圖1 不同菌株、不同免疫劑量家兔免疫效果比較

圖2 不同賦形劑、不同免疫劑量家兔免疫效果比較圖

2.4.2 不同賦形劑、不同免疫劑量家兔免疫效果試驗(yàn) TB05株氫氧化鋁苗、磷酸鋁苗及明礬苗0.1 mL免疫組免疫21 d后，保護(hù)力分別為200、200、100 MLD（家兔最小致死量）、0.5mL組免疫組保護(hù)力均為200MLD（結(jié)果見表1和圖2）。

2.5 血清抗體測定

2.5.1 不同菌株、不同免疫劑量免疫家兔血清抗體效價(jià)測定結(jié)果 對照小鼠2個(gè)MLD即可致死。TB05株磷酸鋁苗0.5mL免疫組0.1ml血清最高可中和300個(gè)MLD（小鼠最小致死量），而C61-4最高只能中和100個(gè)MLD；TB05株磷酸鋁苗0.1mL免疫組0.1mL血清最高可中和200個(gè)MLD（家兔最小致死量），而C61-4最高只能中和100個(gè)MLD（結(jié)果見表2和圖3）。

表2 羊黑疫單價(jià)苗免疫家兔血清抗體中和力測定

圖3 不同菌株、不同免疫劑量免疫家兔血清抗體效價(jià)比較

2.5.2 不同賦形劑、不同免疫劑量免疫家兔血清抗體測定結(jié)果 TB05株氫氧化鋁苗、磷酸鋁苗及明礬苗0.1mL免疫組免疫21 d后，0.1mL血清中和力分別為300、200、100MLD（小鼠最小致死量）、0.5mL組免疫組0.1mL血清中和力分別為400、300、300MLD；（C61-4）磷酸鋁苗0.1mL和0.5mL免疫組免疫21 d后，0.1 mL血清中和力均為100MLD（結(jié)果見表2和圖4）。

3 討論

圖4 不同賦形劑、不同免疫劑量免疫家兔血清抗體效價(jià)比較

3.1 制備濃度高、活性和抗原性強(qiáng)的外毒素是制備高質(zhì)量類毒素疫苗的前提，這不僅取決于細(xì)菌菌株,還與培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)時(shí)間、溫度等條件密切相關(guān)[1]。本試驗(yàn)中所采用的制苗用菌株和培養(yǎng)基均是本實(shí)驗(yàn)室通過前期研究篩選而得，該分離菌株在此培養(yǎng)基上產(chǎn)毒平均可達(dá)2萬MLD/mL，最高可達(dá)4萬MLD/mL，產(chǎn)毒能力為羊黑疫苗制造規(guī)程規(guī)定的0.2～1萬MLD/mL最低毒價(jià)[2]的10倍以上。這對于制備高濃度毒素抗原提供了必要的保障。

3.2 甲醛溶液具有還原作用，它能抑制蛋白質(zhì)活性，目前對外毒素滅活常用的化學(xué)物質(zhì)仍是甲醛，其滅活效果主要與甲醛的濃度、溫度、作用時(shí)間和pH值有關(guān)，雖然采用高濃度的甲醛和高溫滅活，能使其滅活時(shí)間減少，但對抗原的損失也很大[3]。本試驗(yàn)中，用0.5%甲醛，在37℃條件下對外毒素滅活72 h即可達(dá)到脫毒殺菌的效果。安全性試驗(yàn)中，注射5mL菌苗的家兔體重2個(gè)月的觀察期內(nèi)從最初的2.43 kg增長到2.58 kg。表明該菌苗對動(dòng)物的生長影響很小。

3.3 在不同賦形劑、不同免疫劑量免疫家兔免疫效果比較試驗(yàn)中，分離株磷酸鋁苗0.5mL免疫組3種賦形劑菌苗免疫效果無差別，均為200 MLD/mL家兔最小致死量，而0.1mL免疫組免疫效果磷酸鋁苗免疫效果最好，可達(dá)200MLD/mL家兔最小致死量，氫氧化鋁苗和明礬苗僅為100MLD/mL家兔最小致死量。通過不同菌株、不同免疫劑量家兔免疫效果試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離株磷酸鋁苗0.5mL免疫組家兔免疫效果（可抵抗200MLD/mL家兔最小致死量的毒素）和0.1 mL免疫組家兔免疫效果（可抵抗200MLD/mL家兔最小致死量的毒素）均高于標(biāo)準(zhǔn)菌株C61-4磷酸鋁苗0.5mL免疫組免疫效果（100MLD/mL家兔最小致死量的毒素）和0.1 mL免疫組免疫效果（100 MLD/mL家兔最小致死量的毒素）。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，3種賦形劑羊黑疫單價(jià)苗中，磷酸鋁苗家兔免疫效果最好，分離株磷酸鋁苗免疫效果優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)株磷酸鋁苗。

3.4 通過不同菌株、不同免疫劑量家兔免疫效果試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TB05株磷酸鋁苗0.5mL免疫組家兔免疫血清中和抗體（0.1mL血清可中和300 MLD/mL小鼠最小致死量的毒素）和0.1mL免疫血清中和抗體（0.1 mL血清可中和200 MLD/mL）均高于C61-4磷酸鋁苗0.5mL和0.1mL家兔免疫血清中和抗體量（0.1mL血清中和100MLD/m）。不同賦形劑、不同免疫劑量免疫家兔血清抗體效價(jià)比較試驗(yàn)，TB05株磷酸鋁苗0.5mL免疫組氫氧化鋁苗血清中和效價(jià)最高，0.1mL血清可中和400 MLD/mL（小鼠最小致死量）、磷酸鋁苗和明礬苗0.1mL血清可中和300MLD/mL；0.1mL免疫組血清中和效價(jià)氫氧化鋁苗最高，0.1 mL血清可中和300 MLD/mL，磷酸鋁苗次之，可中和200 MLD/mL，明礬苗最低，可中和100MLD/mL。血清中和試驗(yàn)結(jié)果表明，3種賦形劑單價(jià)苗免疫家兔后，其血清抗體中和能力氫氧化鋁苗最高，其次為磷酸鋁苗和明礬苗；TB05株磷酸鋁苗血清中和能力優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)株磷酸鋁苗。

3.5 結(jié)合上述試驗(yàn)，用分離株制備菌液，采用0.5%甲醛溶液37℃作用72 h殺菌脫毒后，用磷酸鋁膠作為賦形劑，制備成羊黑疫磷酸鋁苗免疫家兔，其免疫效果和血清抗體中和效價(jià)均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌株羊黑疫磷酸鋁苗，故該分離菌株和磷酸鋁苗制作方法可用于羊黑疫單價(jià)疫苗的研制。

志謝：本次試驗(yàn)承蒙本院張生民研究員的悉心指導(dǎo)，以及課題組成員的大力幫助。

[1]柴同杰，劉文波.魏氏梭菌毒素疫苗研制及其免疫家兔抗體消長規(guī)律[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005（5）：259-262.

[2] 范克鎖.魏氏梭菌B毒素的提純[J].中國畜禽傳染病，1990（1）：46-50.

[3]王明俊.獸醫(yī)生物制品學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：341-345.