免疫塞內卡病毒滅活疫苗后豚鼠、家兔與豬的血清中和抗體相關性研究

齊志濤，方建國，王娥娥，郝蘇云，高艷華，路 榮，趙麗霞， 范秀麗，張燕紅，杜宇榮，宋慶慶，陳九連

(金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010100)

塞內卡病毒(Senecavirus A，SVA)是近年來新發(fā)的一種豬傳染病，豬感染后發(fā)病癥狀與口蹄疫相似，典型癥狀為鼻盤、蹄冠出現腫脹、水皰或破潰[1]，在臨床上與口蹄疫難以區(qū)分。SVA在我國不同區(qū)域廣泛分布，隨著SVA在豬群當中的不斷傳播，其毒力在逐漸減弱，造成豬群發(fā)生亞臨床感染[2]，嚴重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展及市場交易。目前我國尚無商品化疫苗用以預防該病的發(fā)生與傳播，相關產品還處于研發(fā)階段。在疫苗研發(fā)過程中，產品免疫效力的檢驗是至關重要、不可或缺的環(huán)節(jié)，SVA滅活疫苗的效力檢驗主要依靠本動物進行。近年來，受非洲豬瘟的影響，豬的買賣和運輸受限，造成實驗豬的采購比較困難，導致SVA滅活疫苗的研發(fā)工作受阻。因此，為保障疫苗研發(fā)工作的順利進行，同時也積極響應3R原則[3]，本研究選用豚鼠和家兔這兩種數量多、價格低、運輸便捷的動物，開展豚鼠、家兔與豬免疫SVA滅活疫苗后的血清中和抗體相關性研究，以期在節(jié)約成本、提高效率、保障動物福利的同時，為獸用疫苗效力檢驗工作中實驗動物替代方法的應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 SVA滅活疫苗(懸浮培養(yǎng)，批號為2019001)、用于做中和試驗的SVA病毒液CH/ZZ/2016株、PK-15細胞(豬腎細胞)，由金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國家工程實驗室保存。體重300～500 g的豚鼠和1.5～2.0 kg的家兔各50 只，購自呼和浩特某養(yǎng)殖場；60 日齡以上架子豬15 頭，購自呼和浩特市和林格爾縣某養(yǎng)豬場。

1.2 豚鼠免疫及SVA中和抗體檢測 將50只豚鼠隨機分為5組，分別以0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL的免疫劑量對其中4組豚鼠采用腿部肌肉注射方式免疫，1組作為對照，以相同方式注射2.0 mL生理鹽水。分別于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天連同對照組豚鼠一并采血，分離血清，以《中華人民共和國獸藥典》中的中和試驗法[4]測定SVA中和抗體，數據呈現形式采用log2N表示。

1.3 家兔免疫及SVA中和抗體檢測 將50只家兔隨機分為5組，分別以0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL的免疫劑量對其中4組家兔采用腿部肌肉注射方式免疫，1組作為對照，以相同方式注射2.0 mL生理鹽水。分別于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天連同對照組家兔一并采血，以中和試驗法[4]測定SVA中和抗體，數據呈現形式采用log2N表示。

1.4 豬免疫及SVA中和抗體檢測 選取15頭豬，將其中10頭以最佳免疫方法，即頸部肌肉注射方式免疫2.0 mL SVA滅活疫苗，另外5頭作為對照，以相同方式注射2.0 mL生理鹽水。分別于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天連同對照組豬一并采血，分離血清，以中和試驗法[4]測定SVA中和抗體，數據呈現形式采用log2N表示。

1.5 豚鼠SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性分析 分別計算每組豚鼠及豬免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天的平均中和抗體滴度，利用Microsoft Excel軟件對所得結果進行整理，初步分析豚鼠、家兔與豬血清中SVA中和抗體之間的線性關系，并進一步采用IBM SPSS Statistics 19軟件對線性關系的顯著性進行分析。

1.6 家兔SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性分析 分別計算每組家兔及豬免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天的平均中和抗體滴度，利用Microsoft Excel軟件對所得結果進行整理，初步分析豚鼠、家兔與豬血清中SVA中和抗體之間的線性關系，并進一步采用IBM SPSS Statistics 19軟件對線性關系的顯著性進行分析。

2 結果與分析

2.1 豚鼠免疫后SVA中和抗體檢測結果 對照組豚鼠SVA中和抗體滴度為0，豚鼠免疫后SVA中和抗體滴度呈升高趨勢，高劑量免疫組豚鼠SVA中和抗體滴度高于低劑量免疫組；2.0 mL免疫組豚鼠SVA中和抗體上升速度較其他組快，且SVA中和抗體滴度最高，免疫后第28 d豚鼠SVA平均中和抗體滴度可達210.5，其次為1.0 mL免疫組，免疫后第28 d SVA平均中和抗體滴度達210.3；0.5 mL免疫組在免疫后第28 d平均中和抗體滴度為28.3；0.25 mL免疫組平均抗體滴度最低，免疫后第28 d SVA平均中和抗體滴度為26.3；對照組SVA中和抗體滴度為0(圖1)。結果表明，豚鼠免疫SVA滅活疫苗后，可產生SVA中和抗體，且隨著免疫劑量的增加和時間的延續(xù)，SVA中和抗體滴度逐漸升高。

2.2 家兔免疫后SVA中和抗體檢測結果 家兔免疫后SVA中和抗體變化情況與豚鼠免疫后相似，各組家兔在免疫后SVA中和抗體滴度均呈升高趨勢，高劑量免疫組家兔SVA中和抗體滴度高于低劑量免疫組；2.0 mL免疫組家兔SVA中和抗體滴度高于其他組，在免疫后第28 d家兔SVA平均中和抗體滴度達210.0，其次為1.0 mL免疫組，免疫后第28 d平均中和抗體滴度達27.5；0.5 mL免疫組在免疫后第28 d平均中和抗體滴度為27.16；0.25 mL免疫組SVA平均中和抗體滴度最低，免疫后第28 d為25.0(圖2)。結果表明，家兔在免疫SVA滅活疫苗后，也可產生SVA中和抗體，且隨著免疫劑量的增加和時間的延續(xù)，SVA中和抗體滴度逐漸升高。

圖1 各組豚鼠SVA中和抗體檢測結果Fig 1 Test results of SVA neutralizing antibodies of guinea pigs

圖2 各組家兔SVA中和抗體檢測結果Fig 2 Test results of SVA neutralizing antibody of rabbits

2.3 豬免疫后SVA中和抗體檢測結果 隨著時間的推移，免疫豬SVA中和抗體滴度逐漸上升，免疫后第28 d SVA平均中和抗體滴度可達28.0，對照組中和抗體為0(圖3)。結果表明，豬免疫SVA滅活疫苗后可產生SVA中和抗體，且隨著免疫時間的延續(xù)，SVA中和抗體滴度逐漸升高。

圖3 豬免疫后SVA中和抗體檢測結果Fig 2 Test results of SVA neutralizing antibody of pigs

2.4 豚鼠SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性分析結果 以豬SVA平均中和抗體值為縱坐標，分別以豚鼠0.25 mL免疫組、0.5 mL免疫組、1.0 mL免疫組及2.0 mL免疫組SVA平均中和抗體值為橫坐標做散點圖，繪制豬SVA中和抗體與各免疫組豚鼠SVA中和抗體的回歸曲線，對二者是否存在關系進行初步判斷。圖4結果顯示，各組豚鼠在免疫后SVA中和抗體在一定程度上與免疫豬SVA中和抗體呈正相關，其中豚鼠1.0 mL免疫組SVA中和抗體與免疫豬SVA中和抗體極顯著相關(R2= 0.9942，P<0.01)；豚鼠0.5 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體顯著相關(R2= 0.9833，P<0.05)；豚鼠2.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體顯著相關(R2= 0.9818，P<0.05)；豚鼠0.25 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性不顯著(R2= 0.961，P>0.05)。結果表明，豚鼠SVA中和抗體與豬SVA中和抗體存在線性相關關系，當豚鼠免疫劑量為1.0 mL時，可通過線性回歸方程(y= 0.8131x-0.0971)評估該疫苗在豬體的SVA血清中和抗體水平及消長規(guī)律。

圖4 豚鼠與豬SVA中和抗體回歸曲線Fig 4 Regression curve SVA neutralizing antibody between guinea pigs and pigs

利用IBM SPSS Statistics 19軟件對各組豚鼠與豬SVA中和抗體相關性的差異顯著性，結果見表1。各組豚鼠免疫后SVA中和抗體效價均與豬的中和抗體效價存在一定相關關系，其中，豚鼠1.0 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性最顯著，相關性為0.990(P<0.01)，屬于極顯著相關；豚鼠2.0 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.988(P<0.05)，屬于顯著相關；豚鼠0.5 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.973(P<0.05)，也屬于顯著相關；豚鼠0.25 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.913(P>0.05)，無統(tǒng)計學意義。結果表明，豚鼠1.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性最顯著，且這種相關性具有統(tǒng)計學意義。

表1 豚鼠與豬SVA中和抗體相關性分析Tab 1 Correlation analysis of SVA neutralizing antibody between guinea pigs and pigs

2.5 家兔SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性分析結果 以豬SVA平均中和抗體值為縱坐標，分別以家兔0.25 mL免疫組、0.5 mL免疫組、1.0 mL免疫組及2.0 mL免疫組SVA平均中和抗體值為橫坐標做散點圖，繪制豬SVA中和抗體與各免疫組家兔SVA中和抗體的回歸曲線，對二者是否存在關系進行初步判斷，結果見圖5。各組家兔在免疫后SVA中和抗體在一定程度上與免疫豬SVA中和抗體呈正相關，其中家兔1.0 mL免疫組SVA中和抗體與免疫豬SVA中和抗體極顯著相關(R2=0.9942，P<0.01)；家兔2.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體極顯著相關(R2=0.9885，P<0.01)；家兔0.5 mL免疫組、0.25 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性不顯著(P>0.05)。結果表明，家兔SVA中和抗體與豬SVA中和抗體存在線性相關關系，當豚鼠免疫劑量為1.0 mL時，可通過線性回歸方程(y= 0.813x+0.0971)評估該疫苗在豬體的SVA中和抗體水平及消長規(guī)律。

圖5 家兔與豬SVA中和抗體回歸曲線Fig 5 Regression curve SVA neutralizing antibody between rabbits and pigs

利用IBM SPSS Statistics 19軟件對各組家兔與豬SVA中和抗體相關性緊密程度進行分析，結果見表2。各組家兔免疫后SVA中和抗體效價均與豬的中和抗體效價存在一定相關關系，其中，家兔1.0 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性最顯著，相關性為0.998(P<0.01)，屬于極顯著相關；家兔2.0 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.988(P<0.05)，也屬于極顯著相關；家兔0.5 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.859(P>0.05)，無統(tǒng)計學意義，相關性不顯著；家兔0.25 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.920(P>0.05)，無統(tǒng)計學意義，相關性不顯著。結果表明，家兔1.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性最顯著，且這種相關性具有統(tǒng)計學意義。

3 討論與結論

應用動物試驗替代方法對獸用疫苗檢驗逐漸發(fā)展為許多研究人員的共識，一些學者認為，動物試驗替代方法是疫苗檢驗工作的必然發(fā)展趨勢[5]。理論上講，若替代動物對疫苗抗原的血清學反應存在明確的量效關系，該動物即可成為疫苗效力檢驗的替代動物[6]。疫苗的效力檢驗不一定必須進行本動物攻毒實驗，替代方法建立的關鍵在于建立與傳統(tǒng)檢驗方法的平行關系，并且這種平行關系是穩(wěn)定的，不會隨著產品批次的變化而發(fā)生改變，進而實現等效替代，建立質量標準[6]。

表2 家兔與豬SVA中和抗體相關性分析Tab 2 Correlation analysis of SVA neutralizing antibody between rabbits and pigs

豚鼠和家兔是常用的試驗動物，具有價格低、數量多、運輸便捷等優(yōu)勢。歐洲獸藥典列出多種用豚鼠或家兔替代方法[7]，我國關于獸用疫苗效力檢驗和安全檢驗的替代方法也在不斷進步，部分疫苗效力檢驗和安全檢驗中的本體動物逐漸被豚鼠、兔等實驗動物替代[4]。比如，在豬瘟兔化弱毒疫苗的效力檢驗中，通過兔體定型熱來代替豬體試驗；在豬圓環(huán)病毒2型滅活苗檢驗中，通過免疫鼠、兔替代本體動物，從而解決試驗動物篩選難的問題[8]。

本研究以豚鼠和家兔為試驗動物，以血清學試驗評價SVA滅活疫苗免疫效力，發(fā)現豚鼠和家兔接種SVA滅活疫苗后，均可產生SVA中和抗體，并且抗體滴度隨著免疫劑量的增加而升高，說明豚鼠與家兔可對該疫苗產生血清學反應，并且血清學反應存在明顯量效關系，證明了用豚鼠或家兔替代豬檢驗SVA滅活疫苗效力的可行性。在進一步的統(tǒng)計學分析后發(fā)現，豚鼠和家兔在免疫1.0 mL SVA滅活疫苗后，產生的SVA中和抗體與豬產生的SVA中和抗體具有顯著的線性關系，并且可獲得回歸方程。從而推測，可通過免疫豚鼠或家兔間接反應SVA滅活疫苗在豬體的中和抗體水平，但具體質量標準的建立還需要進一步研究。