甲苯咪唑國家對照品的研制

馬秋冉，楊 星，彭文繡，于曉輝

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

甲苯咪唑是一種廣譜驅(qū)蟲藥，可用于治療蛔蟲、蟯蟲、鉤蟲和鞭蟲的感染。甲苯咪唑在臨床上主要用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]，其制劑為復(fù)方甲苯咪唑粉和甲苯咪唑溶液。目前USP和EP均有該對照品供應(yīng)，但價格昂貴，購買周期長，給國內(nèi)相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)的研發(fā)與生產(chǎn)帶來不便。因此，研制甲苯咪唑?qū)φ掌凡坏梢源_?！吨袊F藥典》2020年版有效實施，還能降低企業(yè)生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

根據(jù)《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》[2]，本次研制分別采用質(zhì)量平衡法、容量法、溯源對照品外標法3種方法對甲苯咪唑原料的含量進行定值研究。其中質(zhì)量平衡法，以有關(guān)物質(zhì)結(jié)果作為純度結(jié)果，同時測定干燥失重、熾灼殘渣等關(guān)鍵指標進行定值；容量法作為原料藥的含量測定方法已被科研工作者普遍認可，其操作簡便、定值準確；采用液相色譜外標法，以USP對照品作為溯源對照品進行定值，以確保含量賦值的準確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器 Waters e2695 高效液相色譜儀(Empower 2 色譜工作站)；Waters 2998 二極管陣列檢測器(PDA)；Waters 2489 紫外檢測器(UV)；Mettler XS205 電子分析天平(精度0.01 mg)；TU-1901 紫外分光光度計；TENSOR27傅里葉紅外光度計；Heratherm OMH100干燥箱；CWF 11/5 高溫爐。

1.2 試 藥 甲苯咪唑原料由江西博萊大藥廠有限公司提供，批號為20200320；甲苯咪唑?qū)φ掌废到y(tǒng)適用性對照品(來源/批號：EP/ Batch 1.2)、甲苯咪唑?qū)φ掌?來源/批號/含量：USP/R096E0/99.7%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 性 狀

2.1.1 顏色 甲苯咪唑原料為白色結(jié)晶性粉末。與《中國獸藥典》2015年版(以下簡稱“獸藥典”)中對甲苯咪唑顏色描述一致。

2.1.2 溶解度 分別考察甲苯咪唑原料在丙酮、三氯甲烷、水、甲酸、冰醋酸、乙醇中的溶解度，測定結(jié)果(表1)與獸藥典中對甲苯咪唑溶解度的規(guī)定一致。

表1 甲苯咪唑原料溶解度Tab 1 The solubilty of mebendazole raw material

2.2 鑒別

2.2.1 紫外鑒別 取2.1.3項下的溶液，考察甲苯咪唑在312 nm的波長處是否有最大吸收。結(jié)果見圖1，甲苯咪唑原料在312 nm的波長處有最大吸收。

圖1 甲苯咪唑原料紫外吸收光譜圖Fig 1 UV spectrum of mebendazole raw material

2.2.2 紅外鑒別 采用溴化鉀壓片法進行測定，采集4000～400 cm-1波段紅外光譜圖，考察甲苯咪唑原料與甲苯咪唑USP對照品的紅外光吸收圖譜是否一致。結(jié)果見圖2和圖3，甲苯咪唑原料的紅外光吸收圖譜與USP對照品的圖譜一致。

圖2 USP對照品紅外光吸收圖譜Fig 2 IR spectrum of USP reference material

圖3 甲苯咪唑原料紅外光吸收圖譜Fig 3 IR spectrum of mebendazole raw material

2.3 質(zhì)量平衡法定值

2.3.1 有關(guān)物質(zhì) 參照《歐洲藥典》9.0中甲苯咪唑質(zhì)量標準進行測定。

2.3.1.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters Xbridge C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：7.5 g/L乙酸銨溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15 min，80% A，20% B; 15～20 min，70% A，30% B; 20～25 min，40% A，60% B; 25～26 min，80% A，20% B; 26～30 min，80% A，20% B)；流速：1.2 mL/min；檢測波長：250 nm；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。

2.3.1.2 供試品溶液的制備 取甲苯咪唑原料約25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.1.3 對照溶液的制備 精密量取供試品溶液1 mL，置200 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.1.4 系統(tǒng)適用性溶液的制備 取甲苯咪唑系統(tǒng)適用性對照品(含雜質(zhì)A、B、C、D、E、F和G)5 mg溶于5 mL DMF中，搖勻，即得。

2.3.1.5 測定結(jié)果 為避免單人操作產(chǎn)生誤差，故選用兩名實驗室人員分別進行獨立的有關(guān)物質(zhì)考察試驗。精密量取系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液和對照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在系統(tǒng)適用性色譜圖(圖4)中，雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G和甲苯咪唑峰與相鄰色譜峰的分離度均符合要求。從色譜圖(圖5)測定結(jié)果看，甲苯咪唑原料有關(guān)物質(zhì)包括七個已知雜質(zhì)和兩個未知雜質(zhì)。按自身對照法以峰面積計算，甲苯咪唑原料純度分別為：99.90%、99.90%、99.92%、99.92%，均值(n=4)為99.91%。

2.3.2 干燥失重 參照《中國獸藥典》2015年版一部附錄0831測定，測得甲苯咪唑原料減失重量分別為0. 13%、0.10%、0.14%、0.12%，均值(n=4)為0.12%。

圖4 有關(guān)物質(zhì)考察的系統(tǒng)適用性溶液色譜圖Fig 4 Liquid chromatogram of system suitability solution in related substance test

圖5 有關(guān)物質(zhì)考察的供試品溶液色譜圖Fig 5 Liquid chromatogram of test solution in related substance test

2.3.3 熾灼殘渣 熾灼殘渣反映無機雜質(zhì)的量。參照《中國獸藥典》2015年版一部附錄0841測定，測得甲苯咪唑原料中熾灼殘渣含量分別0.036%、0.020%、0.040%、0.040%，均值(n=4)為0.034%。

2.3.4 質(zhì)量平衡法計算結(jié)果 采用含量=色譜純度×(1-干燥失重含量-熾灼殘渣含量)×100%計算甲苯咪唑原料中甲苯咪唑含量為99.91%×(1-0.12%-0.034%)×100%=99.76%

2.4 容量法定值 參照《中國獸藥典》2015年版一部中甲苯咪唑質(zhì)量標準進行測定。取本品約0.25 g，精密稱定，加甲酸8 mL溶解后，加冰醋酸40 mL與醋酐5 mL，照電位滴定法(附錄0702 第一法)，用高氯酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。按照含量=F×(V-V空)×T/W供×100%計算甲苯咪唑含量，其中T=29.53 mg/mL，F(xiàn)為高氯酸滴定液(0.1 mol/L)經(jīng)標定后的濃度值。測定結(jié)果分別為99.91%、99.85%、99.93%、99.93%、99.87%，均值(n=5)為99.90%。

2.5 液相色譜外標法定值 參照USP43-NF37中甲苯咪唑質(zhì)量標準進行測定。

2.5.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters Xbridge C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：7.5 g/L乙酸銨溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15 min，80% A，20% B; 15～20 min，70% A，30% B; 20～25 min，40% A，60% B; 25～26 min，80% A，20% B; 26～30 min，80% A，20% B)；流速：1.2 mL/min；檢測波長：250 nm；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。

2.5.2 供試品溶液的制備 取甲苯咪唑原料約25 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加DMF使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.3 對照品溶液的制備 取甲苯咪唑?qū)φ掌芳s25 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加DMF使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.4 雜質(zhì)D儲備液的制備 取雜質(zhì)D 5 mg 置50 mL量瓶中，加DMF溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.5 系統(tǒng)適用性溶液的制備 取甲苯咪唑?qū)φ掌芳s25 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加DMF溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置25 mL量瓶中，加雜質(zhì)D儲備液 125 μL，加DMF稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.6 測定結(jié)果 精密量取系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液和對照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在系統(tǒng)適用性色譜圖(圖6)中，甲苯咪唑峰與雜質(zhì)D峰的分離度為6.8，符合獸藥典規(guī)定。平行制備5份供試品溶液，測定結(jié)果分別為100.14%、100.10%、99.86%、99.68%、99.72%，均值(n=5)為99.90%。

圖6 高效液相色譜外標法系統(tǒng)使用性溶液Fig 6 Liquid chromatogram of system suitability solution in assay

3 討 論

國家對照品的研制過程中，最重要的就是確保定值準確?！稑藴饰镔|(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》中列出5種定值方式，單一實驗室通常采用兩種或更多不同原理的獨立參考方法定值。因此，本次研究采用質(zhì)量平衡法、容量法、高效液相色譜法3種不同原理的定值方法測定甲苯咪唑的含量，測定結(jié)果基本一致，相互佐證，充分說明了定值的準確性。

有效期是標準物質(zhì)的重要變量，也是研制中關(guān)注的重點之一[3]。目前，歐洲藥品質(zhì)量管理局(EDQM)、美國藥典委員會(USP)和中國食品藥品檢定研究院(NIFDC)等機構(gòu)均采用定期檢測穩(wěn)定性后，通過網(wǎng)站等方式告知客戶是否穩(wěn)定，能否繼續(xù)使用的方式代替規(guī)定有效期。這種方式不但避免了由于有效期制定過長產(chǎn)生的用戶測定結(jié)果偏差的情況，還能減少有效期制定過短帶來的浪費現(xiàn)象。本次研制的甲苯咪唑?qū)φ掌芬膊灰?guī)定有效期，通過定期監(jiān)測穩(wěn)定性的方式來保證在售對照品的產(chǎn)品質(zhì)量。