貂源綠膿桿菌流行株toxA基因克隆序列分析及原核表達

張傳美，王　穎，秦曉冰，楊海燕，秦志華，單　虎（.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島6609；.煙臺市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東煙臺64000）

貂源綠膿桿菌流行株toxA基因克隆序列分析及原核表達

張傳美1，王穎2，秦曉冰1，楊海燕1，秦志華1，單虎1
（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109；2.煙臺市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東煙臺264000）

摘要：為了研究貂源綠膿桿菌流行株toxA基因的遺傳變異情況，并將toxA基因進行原核表達，本試驗以貂源綠膿桿菌DNA為模板，經(jīng)PCR擴增表達外毒素A蛋白的toxA基因，約1 917 bp的片段，將產(chǎn)物克隆與pMD-18T載體并測序。結(jié)果表明，12株流行株的序列與GenBank中的標準產(chǎn)毒株P(guān)A103株和PA01株的遺傳關(guān)系較近，顯示外毒素A毒性的氨基酸均未發(fā)生突變，流行株變異不大。將該基因亞克隆到原核表達載體pET32a，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞,經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE與Western Blot鑒定，結(jié)果表明，可產(chǎn)生相對分子量約為78 kDa的表達產(chǎn)物，成功地構(gòu)建了外毒素A蛋白的重組表達系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞：綠膿桿菌；toxA基因；克??；序列分析；原核表達

Corresponding author：SHAN Hu

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）又稱銅綠假單胞菌，屬于假單胞菌科、假單胞菌屬，是一種常見條件致病菌，可引起人及多種動物（如雞、兔、羊、水貂等）發(fā)病。1972年，P v Liu在臨床分離株的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致綠膿桿菌感染的毒性因子-外毒素A，并指出綠膿桿菌外毒素A（Pseudomonas ae?ruginosa exotoxin A，PEA）對皮膚黏膜有壞死作用，進入血液中能誘發(fā)敗血癥，是綠膿桿菌感染機體的最主要致病因子[1]。PEA由toxA基因編碼，該基因由3個部分組成：Ⅰ區(qū)的Ⅰa（1-252AA）、Ⅰb（365-404AA）為識別部分，Ⅱ區(qū)（253 -364 AA）為“越膜轉(zhuǎn)位”部分，Ⅲ區(qū)（4O5-613AA）為毒素分子的酶活性部分。toxA基因通過受體結(jié)合亞單位和跨膜亞單位將具有ADP-核糖基化活性的毒性單位導(dǎo)人細胞，催化細胞內(nèi)的延長因子（EF-2）發(fā)生ADP-核糖基化反應(yīng)，使EF-2滅活，抑制蛋白合成而殺死細胞[2-3]。

目前研究對動物源性綠膿桿菌外毒素A序列變異規(guī)律的系統(tǒng)報道較少，為了解山東地區(qū)貂源綠膿桿菌流行毒株的變異規(guī)律，本研究對本室分離鑒定得到的貂源綠膿桿菌toxA基因進行了克隆、測序及遺傳變異分析，并將該基因進行原核表達，為研究該病的致病機理及開發(fā)新型的亞單位疫苗和診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料試驗用菌株分離自山東地區(qū)水貂養(yǎng)殖場，由本實驗室分離鑒定并保存；宿主菌E.coli DH5α、BL21（DE3）株、載體pET32a（+）均由本室保存。pMD18-T載體克隆試劑盒、ExTaq DNA聚合酶、EcorI、HindⅢ、ApaI限制性內(nèi)切酶、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒等，均購自TaKaRa公司；X-gal、IPTG，購自Merk公司；PVDF膜，購自Milli?pore公司；6×His單克隆抗體（RGS），購自Novagen公司。

1.2toxA基因的擴增與克隆參照GenBank上的綠膿桿菌PA103參考株設(shè)計toxA基因引物，預(yù)期產(chǎn)物長度1 917 bp，并在引物兩端加EcoRI和Hin?dIII酶切位點。以分離純化的細菌培養(yǎng)液為模版，按常規(guī)方法進行PCR反應(yīng)，PCR擴增條件：94℃5 min；94℃1 min，61℃1 min，72℃3 min，循環(huán)30次；72℃延伸20 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像觀察分析。引物序列如下：P1：5′- GAATTCATGCACCTGACACCCCATTG- 3′，P2：5′-CAAGCTTCTTCAGGTCCTCGCGCGGCG-3′。

1.3連接、轉(zhuǎn)化和鑒定使用DNA Fragment Puri?fication Kit膠純化回收。按照Pmd18-T Vector操作說明，將回收鑒定后的DNA與pMD18-T載體進行連接，連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆。隨機挑取白色單菌落，提取質(zhì)粒DNA。對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定和酶切鑒定。

1.4toxA全基因的序列測定及分析將鑒定為陽性克隆的菌液送華大基因科技服務(wù)有限公司測序。利用DNAStar和DNAMAN軟件對所測定的toxA基因全長的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進行編輯及密碼子分析，并與GenBank上已發(fā)表過已知產(chǎn)毒株P(guān)A103和不產(chǎn)毒株P(guān)A01參考毒株序列分別進行核苷酸序列比對分析，并繪制系統(tǒng)進化樹。

1.5原核表達載體的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達以pMD18-T-toxA為模板，經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切后膠回收，獲得具有黏性末端的基因片段。將回收的toxA基因片段與pET32a載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆做PCR鑒定和酶切鑒定，鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pET32a-toxA。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，選取重組菌接種Amp+的LB培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)至OD600值為0.6-1.0時，加入不同濃度IPTG（0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L）誘導(dǎo)表達6 h。收集1 mL菌液離心，重復(fù)3次，加入100 μL 2×SDS上樣緩沖液，水浴煮3～5 min，未誘導(dǎo)菌液和誘導(dǎo)空載體菌pET32a（+）作相同處理后，進行SDS-PAGE。

1.6WesternBlot檢測參照分子克隆試驗指南進行電轉(zhuǎn)印，WesternBlot檢測，一抗為6×His的單克隆抗體，二抗為HRP標記羊抗鼠（酶標IgG二抗）。

2　結(jié)果

2.1目的片段的PCR擴增、克隆及鑒定從15株綠膿桿菌中有12株擴增出toxA基因片段，分別命名為PA1、PA2、PA3、PA4、PA5、PA6、PA7、PA8、PA9、PA10、PA11和PA12，瓊脂糖凝膠電泳證明，擴增片段大小與預(yù)期相符，約為1 917 bp。將擴增出的片段用pMD-18T載體進行克隆，所得重組質(zhì)粒分別進行PCR鑒定和EcoRⅠ、Hind III雙酶切鑒定。陽性質(zhì)粒擴增出預(yù)期大小的基因片段1 917 bp（見圖1），雙酶切后均呈現(xiàn)目的條帶和載體兩條帶（見圖2）。

圖1　重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

圖2　重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.2toxA基因同源性分析及氨基酸序列比對12株山東水貂源綠膿桿菌流行株toxA基因與PA103參考株的核苷酸和氨基酸同源性分別為97.7%～99.1%和96.2%～97.2%，與PA01參考株的同源性分別為98.0%～99.5%和96.7%～97.9%，山東水貂源綠膿桿菌流行株之間核苷酸同源性為98.2%～100%，氨基酸同源性為97.3～99.8%。表明山東近期流行的綠膿桿菌毒株與參考株變異不大，且流行毒株之間同源性較高。與PA103為參考株比較發(fā)現(xiàn)，PA1至PA10株的37位Thr變?yōu)镻ro，PA1至PA10株的179位Thr變?yōu)锳la，PA12 的313位Arg變?yōu)镚ly，407位Val變?yōu)镮le，PA1至PA12株的364位Asn變?yōu)镾er，515位Gly變?yōu)镾er。與PA01株位參考株比較發(fā)現(xiàn)，PA1至PA10株的37位Thr變?yōu)镻ro，PA12的313位Arg變?yōu)镚ly，PA1至PA11株的407位Ile變?yōu)閂al。

2.3toxA基因遺傳進化分析利用DNAStar軟件與12株流行株toxA基因序列進行比較，繪制toxA基因基因系統(tǒng)進化樹。由圖3可以看出，PA2、PA3、PA4、PA7、PA8、PA9、PA10、PA11與PA103、PA01遺傳關(guān)系較近，PA11與PA01遺傳關(guān)系最近，PA1、PA5、PA6與PA103、PA01遺傳關(guān)系較遠，PA12與PA103、PA01遺傳關(guān)系相對較遠。由此推斷，目前山東水貂源綠膿桿菌流行株與PA11與PA01遺傳關(guān)系較近，流行株變異不大。

2.4重組質(zhì)粒pET32a -toxA的鑒定及原核表達以pET32a-toxA為模板擴增toxA基因，所獲得的片段大小與預(yù)期1 917 bp相符。pET32a-toxA重組表達載體經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切后，在瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)2條大小分別為約6 900 bp和1 917 bp的DNA片段，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符。這表明toxA基因已正確插入pET32a載體EcoR I和Hind III酶切位點之間。

圖3　山東12株綠膿桿菌toxA基因進化樹

SDS-PAGE分析，在78 kDa處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表達產(chǎn)物在1.0 mmol/L時表達量較高（圖4）。WesternBlot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)印的PVDF膜上出現(xiàn)與預(yù)期大小相同的條帶，而對照組相應(yīng)位置無此條帶。這說明表達的蛋白為pET32a融合的toxA蛋白。

圖4　不同誘導(dǎo)劑濃度的表達產(chǎn)物

圖5　表達重組蛋白的Western Blot檢測

3　討論

近年來，山東地區(qū)水貂養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，以綠膿桿菌為主要病原菌引發(fā)的水貂出血性肺炎頻繁暴發(fā)，且多呈繼發(fā)感染、混合感染和群體急性暴發(fā)的趨勢，不僅造成巨大經(jīng)濟損失，而且給臨床治療該病帶來了更大的困難[4]。本試驗通過對山東12株貂源綠膿桿菌toxA基因克隆與序列分析，研究了綠膿桿菌主要致病因子外毒素A的遺傳變異情況。外毒素AIa區(qū)的定點誘變研究發(fā)現(xiàn)[5]，當將第57位賴氨酸（Lys57）誘變?yōu)楣劝彼幔℅lu）時，突變的PE細胞毒性減低到1%，Ia區(qū)上其他Lys位點的突變對PE細胞毒作用無任何影響?？梢?，Lys57是Ia區(qū)的關(guān)鍵的氨基酸位點。除Lys57外，位于I區(qū)的His246，Arg247和His249三個堿性氨基酸也是維持PE生物學(xué)活性的重要位點。在突變型PEGlu246，247，249和PEGlu57，246，247，249，上述堿性氨基酸已由Gfu替換，使Ia區(qū)與Ⅱ區(qū)間連接的氫鍵受阻斷，它們對動物顯示低的細胞毒性。外毒素AⅡ區(qū)在毒素跨膜轉(zhuǎn)位過程中起主導(dǎo)作用。當Ⅱ區(qū)缺失時，盡管其細胞結(jié)合能力和ADP-核糖基化活性尚存，但細胞毒性喪失。Arg276向Gly的點突變造成PE分子完全喪失細胞毒性，Arg279向Gly的點突變引起細胞毒作用減低到l/400。Wozniak等[6]通過對國際標準產(chǎn)毒株P(guān)Al03及不產(chǎn)毒株P(guān)A01的研究表明，第426位組氨酸對于外毒素的ADP-核糖基化作用是必須的。Douglas等及Carroll等[7-8]的研究表明，第553位谷氨酸及558位色氨酸對于外毒素AⅢ區(qū)的ADP-核糖基化作用是關(guān)鍵的。還有其他研究表明，第440位組氨酸，470，481位酪氨酸對酶活性及細胞毒性是重要的[9-10]。而12株水貂綠膿桿菌toxA基因測序結(jié)果表明，這些位點的氨基酸均未發(fā)生突變，可以推斷該菌株細胞毒沒有降低，具有ADP-核糖基化作用，但仍須做進一步研究。這些突變中，氨基酸的性質(zhì)均有改變，這些改變是否對其毒性有影響，將有待進一步研究。

通過toxA基因的序列分析，表明山東地區(qū)近期綠膿桿菌流行毒株與參考株變異不大，且流行毒株之間同源性較高，流行毒株與PA103與PA01遺傳關(guān)系較近。目前山東地區(qū)流行的水貂綠膿桿菌病的有關(guān)外毒素A毒性的氨基酸均未發(fā)生突變，可以推斷菌株細胞毒沒有降低，且流行株變異不大。綠膿桿菌外毒素A由toxA基因編碼（其CDS全長為1 917 bp），分子量約為66 kDa，由613個氨基酸組成,其前體為638 aa，在分泌過程中切去了由25 aa組成的高度疏水的引導(dǎo)肽。正常情況下，toxA基因的表達受到多種調(diào)控基因的調(diào)節(jié)，如regA（toxR）、regB、lasR、ptxR、vfr（毒力因子調(diào)控基因）、pvds等正調(diào)控基因和fur（鐵吸收調(diào)節(jié)基因）、ptxS等負調(diào)控基因。此外，培養(yǎng)溫度、氧通氣量、鐵離子濃度及谷氨酸鹽等環(huán)境因素亦影響其表達[11]。

綠膿桿菌基因組GC含量高達66%，從高GC含量的模板中用PCR方法擴增長片段DNA序列是件相當困難的事情[12]。為了能從高GC含量模板中進行有效的PCR擴增，本試驗首先使用了Ex Taq酶，Ex Taq酶在普通PCR條件下，與普通Taq DNA Polymerase相比，具有擴增效率高、錯配率低的優(yōu)良性能。其次在PCR擴增體系中加入4.8%甘油和4%二甲基亞砜（DMSO）也是PCR擴增成功的關(guān)鍵所在，甘油的作用是提高PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，增加酶的穩(wěn)定性；二甲基亞砜的作用是改善高GC含量的DNA變形情況，使聚合酶在二級結(jié)構(gòu)處延伸。在構(gòu)建原核融合表達載體時，選用了帶T7 Lac原核啟動子的pET32a（+)融合表達載體，該載體可高效表達外源蛋白，表達的融合蛋白的N端帶有6個連續(xù)組氨酸融合標簽，與其他純化系統(tǒng)相比，其獨特的優(yōu)點是6個組氨酸尾空間構(gòu)像小而且不帶電荷，不會影響融合蛋白的分泌、重折疊、結(jié)構(gòu)和功能以及目的蛋白的性能，最大限度保持其活性，也不會對動物機體產(chǎn)生任何副反應(yīng)，因此不需要對融合蛋白進行切割處理，大大簡化了操作步驟，降低了生產(chǎn)成本。本試驗PEA的成功表達，為大量表達純化該蛋白做了前期工作，更為進一步研究其性質(zhì)和功能奠定了基礎(chǔ)，為用于免疫導(dǎo)向治療的重組毒素和人工疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。

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王穎（1986-），女，助理獸醫(yī)師，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：wangying1986@163.com

注：王穎與張傳美對本文具有同等貢獻

Cloning，Sequenceanalysis and Prokaryotic expressionof the toxA Geneof Pseudomonasaeruginosafrom Minks

ZHANG Chuan-mei1，WANG Ying2，QIN Xiao-bing1，YANG Hai-yan1，QIN Zhi-hua1，SHAN Hu1
（1.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Yantai Animal Health Supervision Institute，Yantai 264000，China）

Abstract：To study the genetic variation of the toxA gene of P.aeruginosa from minks and its expression in E.coli.A 1917 bp fragment the toxA gene was amplified from the genomic DNA of P.aeruginosa from mink by PCR，and cloned into pMD18-T vec?tor.Sequencing analysis showed that 12 strains had close genetic relationship with PA103 and PA01 corresponding sequences pub?lished in the GenBank.Amino acids with toxicity of toxA gene are not mutated.The toxA gene was expressed into the prokaryotic ex?pression vector pET32a，and the constructed recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21（DE3）competent cells . A 78KDa fusion protein was expressed after different concentration IPTG induction and confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis.The recombinant expression system containing the toxA protein of Pseudomonas aeruginosa has been established success?fully.

Key words：P.aeruginosa；toxA gene；clone；Sequence analysis；Prokaryotic expression

通訊作者：單虎，E-mail:shanhu67@163.com

作者簡介：張傳美（1978-），女，副教授，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：zhangchuanmei100@163.com

基金項目：青島市科技計劃基礎(chǔ)研究項目[11-2-4-5-（3）-jch]；科技基礎(chǔ)性工作專項（SQ2012FY3260033）；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金項目（BS2011SW010）

收稿日期：2015-05-23

中圖分類號：S852.61

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0038- 04