菌毒清口服液治療人工感染雞傳染性鼻炎試驗

牛建榮，張繼瑜，周緒正，李劍勇，李　冰，魏小娟，楊亞軍，劉希望（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州730050）

菌毒清口服液治療人工感染雞傳染性鼻炎試驗

牛建榮，張繼瑜，周緒正，李劍勇，李冰，魏小娟，楊亞軍，劉希望
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州730050）

摘要：為了觀察“菌毒清”口服液對人工感染雞傳染性鼻炎的治療效果與現(xiàn)有的治療雞呼吸道疾病的中藥“瘟毒清”口服液療效進(jìn)行比較。試驗分為7組，包括2.0%、1.5%、1.0%和0.5%“菌毒清”飲水治療組，1.0%“瘟毒清”飲水治療組，陽性空白對照組和陰性空白對照組，雞只自由飲用，連用7 d為1療程。經(jīng)1個療程的治療，“菌毒清”治療組的治愈率分別為69.23%、77.78%、81.48%和62.96%，“瘟毒清”組的治愈率為78.57%；“菌毒清”治療組的有效率分別為88.46%、88.80%、94.81%和81.48%，“瘟毒清”治療組的有效率為89.29%；不同劑量“菌毒清”治療組的有效率與“瘟毒清”治療組差異不顯著，但不同藥物治療組與陽性空白對照組差異顯著（P<0.05）。表明“菌毒清”是治療雞傳染性鼻炎的有效藥物之一。

關(guān)鍵詞：“菌毒清”口服液；雞傳染性鼻炎；療效

雞傳染性鼻炎（Infectious coryza，IC）是由副雞嗜血桿菌（Haemophilus gallinarum，HPg）所引起雞的急性呼吸系統(tǒng)疾病。本病發(fā)生于各種年齡的雞，老齡雞感染較為嚴(yán)重。主要癥狀為鼻腔與鼻竇發(fā)炎，流鼻涕，臉部腫脹和打噴嚏。

育成雞感染傳染性鼻炎，生長遲緩，死亡率上升；產(chǎn)蛋雞感染后，常引起產(chǎn)蛋率下降，而在產(chǎn)蛋高峰期或高峰期以后的雞群感染傳染性鼻炎，產(chǎn)蛋量可下降70%。

課題組根據(jù)養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)需要，篩選出治療雞呼吸道傳染性疾病的復(fù)方中藥制劑“菌毒清”口服液。該制劑根據(jù)傳統(tǒng)中獸醫(yī)學(xué)理論，以板藍(lán)根、黃連、黃芩等組方，運用現(xiàn)代制藥技術(shù)，精制而成。本試驗的目的在于觀察“菌毒清”對人工感染雞傳染性鼻炎的治愈率、有效率。并與陽性對照藥物“瘟毒清”口服液進(jìn)行比較，統(tǒng)計分析各組間的差異性，評價“菌毒清”治療雞傳染性鼻炎的藥效。

1　材料

副雞嗜血桿菌（HPg）：北京標(biāo)準(zhǔn)株A型，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。用于人工感染細(xì)菌?！熬厩濉笨诜海河糜谥委熑斯じ腥倦u傳染性鼻炎患雞。由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制。規(guī)格為每1 mL含生藥1 g。批號：20130311?！拔炼厩濉笨诜簩φ账幬?，用于治療人工感染雞傳染性鼻炎患雞。由天津市挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司提供[獸藥字（2006）020115030]。濃度為每1 mL含生藥1 g。雞胚100枚，用于測定副雞嗜血桿菌雞胚半數(shù)致死量（ELD50）和雞胚傳代培養(yǎng)。自己孵化的7日齡非免疫雞胚。試驗雞為三黃雞，350只，70日齡未免疫，經(jīng)臨床觀察均為健康。購自蘭州市榆中養(yǎng)雞場。用于測定雞半數(shù)感染量（ID50）；人工感染雞傳染性鼻炎患雞模型。

2　方法

2.1副雞嗜血桿菌（HPg）的培養(yǎng)

2.1.1種子液的培育將副雞嗜血桿菌北京標(biāo)準(zhǔn)株A型培養(yǎng)液進(jìn)行5倍稀釋，作為原液,劃線培養(yǎng)于雞肉湯瓊脂平板上，置37℃含5%～10% CO2（體積分?jǐn)?shù)，下同）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h～18 h，在斜射光線的顯微鏡下觀察,選擇熒光強(qiáng)的典型菌落接種于雞肉湯中,同樣條件下培養(yǎng)18 h～20 h。用雞肉湯瓊脂平板進(jìn)行雜菌檢驗,無雜菌而生長出典型HPg菌落者即為種子液。

2.1.2雞胚接種與收獲取繁殖好的HPg種子液,接種7日齡雞胚卵黃囊，0.2 mL/胚。置37℃條件下繼續(xù)孵化，觀察124 h，死亡的雞胚分別收取卵黃、尿囊液及絨毛膜，研磨離心，取上清液。用雞肉湯瓊脂平板進(jìn)行雜菌檢驗,生長出典型HPg菌落且無雜菌的留用[1]。

2.1.3細(xì)菌計數(shù)細(xì)菌計數(shù)按農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《獸醫(yī)微生物制品規(guī)程》進(jìn)行，以10-1，10-2，10-3……10-6稀釋，然后取0.1 mL稀釋液均勻地涂抹在雞肉湯瓊脂平板上,每個稀釋度做2板,置于37℃含5%～10% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～20 h，2板的平均數(shù)即為該稀釋度的細(xì)菌數(shù)。

2.2雞胚半數(shù)致死量（ELD50）測定取死亡雞胚的卵黃、尿囊液及絨毛膜的離心上清液，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度稀釋后接種雞胚。采用FT-K數(shù)字智能化孵化機(jī)。所用SPF雞胚為自行孵化，取7日齡雞胚50枚。每個雞胚分別接毒100、10-1、10-2、10-3、10-4梯度的稀釋液0.2 mL，每個稀釋梯度用10枚雞胚37℃，56%相對濕度下孵化，3 h翻蛋1次。棄去48 h內(nèi)死亡雞胚，觀察124 h，詳細(xì)記錄死亡與存活數(shù)。無菌收集72 h～148 h死亡雞胚，3 500 r/min離心，取上清液，-20℃保存待用。按Reed-Menuch氏法計算HPg雞胚半數(shù)致死量（ELD50）。

2.3HPg的雞半數(shù)感染量ID50試驗雞為70日齡的未免疫的肉用三黃雞50只，初試體重1.69～2.27 kg，每個試驗組15只（分為3組）。將雞保定好，找到氣管，在氣管內(nèi)注射HPg上清液稀釋液1.0 mL。測定其對雞的半數(shù)感染量（ID50）。另5只為健康對照組，不做任何處理。連續(xù)觀察14 d。按Reed-Menuch氏法計算HPg雞半數(shù)感染量（ID50）。

2.4“菌毒清”治療試驗依據(jù)農(nóng)業(yè)部1992年《實驗臨床試驗技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行“菌毒清”治療試驗。

2.4.1分組70日齡未免疫的三黃雞300只，經(jīng)臨床檢查均為健康。分為“菌毒清”4組（2.0%、1.5%、1.0%和0.5%）、“瘟毒清”治療組、陽性對照組及陰性（空白）對照組。見表1。

表1　試驗動物分組與用藥

2.4.2攻毒除健康對照組外，按照雞半數(shù)感染量（ID50），用制備的HPg感染用稀釋液（10- 1稀釋），每只雞氣管內(nèi)滴注射1.0 mL。

2.4.3治療在雞出現(xiàn)較典型的臨床癥狀后（48 h）開始用藥，各組按試驗設(shè)計準(zhǔn)確用藥，將“菌毒清”按2.0%、1.5%、1.0%和0.5%的濃度分別加入飲水中，供相應(yīng)組病雞不限量自由飲用；以相同方法將“瘟毒清”按1.0%濃度分別加入飲水中，供藥物對照組病雞自由飲用，亦不限量。連續(xù)用藥7 d 為1療程。陽性對照組致病，但不用任何藥物治療?？瞻讓φ战M既不致病，也不用任何藥物。

2.4.4觀察每天觀察各組雞只臨床癥狀、雞只死亡情況并進(jìn)行詳細(xì)記錄。進(jìn)行病理剖檢。進(jìn)行實驗室病菌確診驗證：進(jìn)行細(xì)菌分離，染色鏡檢菌體，血清學(xué)鑒定。試驗結(jié)束后，統(tǒng)計治療結(jié)果，分析各組間差異，推薦臨床治療劑量，對“菌毒清”藥效進(jìn)行評價。

3　結(jié)果

3.1雞胚接種出現(xiàn)典型癥狀雞胚接種出現(xiàn)絨毛膜變渾濁、變厚及形成痘斑。在雞肉湯瓊脂上生長出圓形、灰白色、半透明、凸起的小菌落。見中插彩版圖1、圖2。

3.2HPg的ELD50測定結(jié)果見表2。

表2　HPg的ELD50測定結(jié)果

LgEID50=-1+0.32×（-1）=-1.32 EID50=10-1.32/0.2 mL

該病菌的毒價為EID50=10-1.32/0.2 mL，可以引起雞胚124 h內(nèi)半數(shù)發(fā)生死亡，據(jù)此確定該病毒對雞胚的感染劑量為每只100、10-1、10-2/0.2 mL。剖檢雞胚可見絨毛尿囊膜（CAM）水腫、增厚,有數(shù)量不等、大小不一、不透明的灰白色痘斑,胚體表面出血等HPg的特征性病變。

3.3HPg的雞半數(shù)感染量ID50測定結(jié)果結(jié)果見表3。

表3　各組的潛伏期、發(fā)病率、死亡率

距離比值=（80.00%-50%）/（80.00%-26.32%）= 30/53.68=0.56

Lg ID50=-1+0.0.56×（-1）=-1.56 ID50=10-1.56/1.0 mL

該菌株的毒價為ID50=10-1.56/1.0 mL，可以引起雞半數(shù)感染，據(jù)此確定HPg對雞的感染劑量為每只10-1、10-2/1.0 mL。

3.4“菌毒清”治療試驗結(jié)果

3.4.1臨床癥狀48 h開始出現(xiàn)癥狀，鼻孔先流出清液以后轉(zhuǎn)為漿液黏性分泌物，有時打噴嚏，流鼻液，呼吸困難，并有啰音，病雞搖頭，欲將呼吸道內(nèi)的黏液排出,臉腫脹或顯示水腫，結(jié)膜發(fā)炎，眼瞼腫脹。病雞精神沉郁，食欲及飲水減少，部分雞拉稀，面部浮腫，縮頭，呆立，公雞肉髯腫大，個別雞咽喉積有分泌物的凝塊，最后常窒息而死。

3.4.2病理剖檢主要病變?yōu)楸乔缓捅歉]黏膜呈急性卡他性炎，充血、腫脹，表面覆有大量黏液，竇內(nèi)有滲出物凝塊，后成為干酪樣壞死物。常見卡他性結(jié)膜炎，結(jié)膜充血、腫脹。臉部及肉髯皮下水腫。嚴(yán)重時可見氣管黏膜炎癥，偶有肺炎及氣囊炎。

3.4.3實驗室病菌確診驗證參照農(nóng)業(yè)部頒布的《雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)》（NY/T 538-2002）進(jìn)行確診驗證。

3.4.3.1細(xì)菌分離取急性發(fā)病雞、癥狀明顯的雞，將滅菌的棉拭插入竇腔內(nèi)部，無菌操作劃直線接種在雞血清雞肉湯瓊脂平板，然后再用葡萄球菌在平板上劃橫線，37℃，10% CO2培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況。

3.4.3.2染色鏡檢菌體取分離菌株涂片，革蘭染色鏡檢菌體形態(tài)?？梢姼锾m陰性，兩極濃染，單個、成對或形成鏈狀排列的小桿菌。

3.4.3.3血清學(xué)鑒定用已知的傳染性鼻炎抗血清檢驗分離的被檢菌。在載玻片上放1滴抗血清和1滴生理鹽水，然后向其中分別加入用被檢菌制備的抗原各1滴，充分混合后，轉(zhuǎn)動玻片3～5 min，如果血清滴處出現(xiàn)凝集而生理鹽水滴處不凝集，即可判定被檢菌為副雞嗜血桿菌[2]。

3.4.4治療統(tǒng)計分析結(jié)果見表4。

表4　療效統(tǒng)計分析（治療期7 d）

從表4可以得出，除G組（健康對照組）外，在290只致病雞中，發(fā)病262只，副雞嗜血桿菌人工感染后發(fā)病率為86.67%～95.00%，平均90.34%（262/290）。經(jīng)1個療程的治療，4個“菌毒清”組的治愈率為62.96%～81.48%，瘟毒清組的治愈率為78.57%；4個“菌毒清”組的有效率為81.48%～94.81%，瘟毒清組的有效率為89.29%。其中以“菌毒清”3組（1.0%菌毒清）的有效率和治愈率最高，比瘟毒清組高5.52個百分點，效果顯著。經(jīng)統(tǒng)計分析，“菌毒清”4個試驗組和“瘟毒清”組與陽性對照組差異顯著（P<0.05）；“菌毒清”4個試驗組和“瘟毒清”組相互之間差異不顯著。

4　結(jié)論

試驗結(jié)果表明，“菌毒清”口服液治療效果“瘟毒清”治療效果稍好?！熬厩濉笨诜喊凑?.0%比例飲水給藥，效率高，治療費用低，推薦“菌毒清”口服液用量按照1.0%濃度飲水給藥。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱士盛，王新.雞傳染性鼻炎實驗室診斷技術(shù)[J].中國動物檢疫，1995，12（4）：12-14.

[2]趙金紅，杜春梅，孫麗波，等.雞傳染性鼻炎的診斷與防治[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，32（S）：43-44.

Effects of Junduqingoral liquid for artificial avian infectious coryza

NIU Jian-rong，ZHANG Ji-yu，ZHOU Xu-zheng，LI Jian-yong，
LI Bing，WEI Xiao-juan，YANG Ya-jun，LIU Xi-wang （Key Lab of New Animal Drug Project，Gansu Province，Key Lab of Veterinary Drug Development，
Ministry of Agriculture，Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciencesof CAAS，Lanzhou 730050，China）

Abstract：To estimate the efficacy of traditional Chinese medicine preparation Junduqing oral liquid for chicken respiratory disease，the chickens were artificially infected by Haemophilusgallinarum . In our study traditional Chinese medicine Wenduqing was set as the control drug.The chickens were randomly divided into 7 groups，which contained four therapeutical groups of 2.0%，1.5%，1.0% and 0.5% Junduqing in water，and three control groups of 1.0%Wenduqing in water，positive control group and nega?tive control group.The water with drug was drunk freely in every group for seven days as a course of treatment.The results showed that the cure rates of the four therapeutical groups were 69.23%，77.78%，81.48% and 62.96% respectively，and Wenduqing con?trol group was 78.57%.The effective rates of these 4 groups with Junduqing were 88.46%，88.80%，94.81% and 81.48% respective?ly, andWenduqing was 89.29%.There was no significant differences in cure rate and effective rate between 4 Junduqing therapeuti?cal groups and Wenduqing control group.However，there had significant differences between these five groups and the positive con?trol group（P<0.05）.The experiment demonstrated that Junduqing was an effective traditional Chinese medicine preparation for avi?an infectious coryza and was better than Wenduqing in same dosage.

Key words：Junduqing oral liquid preparation；avian infectious coryza；efficacy

作者簡介：牛建榮（1968-），男，副研究員，碩士，從事獸醫(yī)臨床和新獸藥開發(fā)研究，E-mail：lznjr1968@126.com

基金項目：農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項：防治畜禽衛(wèi)氣分證中獸藥生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用（201303040-09）

收稿日期：2014-4-24

中圖分類號：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0087- 03