乙醇胺修飾的石墨烯量子點的合成及生物成像應(yīng)用

曾敏翔，陳　翔，謝虞清，管　劍，甄杰明，朱先軍，楊上峰

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)材料科學(xué)與工程系 中國科學(xué)院能量轉(zhuǎn)換材料重點實驗室合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家實驗室，安徽 合肥，230026)

乙醇胺修飾的石墨烯量子點的合成及生物成像應(yīng)用

曾敏翔，陳翔，謝虞清，管劍，甄杰明，朱先軍，楊上峰

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)材料科學(xué)與工程系 中國科學(xué)院能量轉(zhuǎn)換材料重點實驗室合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家實驗室，安徽 合肥，230026)

摘要：作為新一代基于碳材料的量子點，乙醇胺(Ethanolamine，ETAM)修飾的石墨烯量子點(ETAM-GQDs)成功地通過一步水熱法被合成出來，并通過實驗顯示出在生物成像應(yīng)用中的潛力。以檸檬酸作為碳源、甘氨酸作為橋聯(lián)劑，通過乙醇胺/去離子水共溶劑水熱法，成功地實現(xiàn)了在石墨烯量子點表面修飾乙醇胺得到ETAM-GQDs。通過原子力顯微鏡(AFM)、光電子能譜(XPS)、拉曼光譜等對ETAM-GQDs進行表征，在測得ETAM-GQDs的穩(wěn)態(tài)熒光光譜后，通過使用硫酸奎寧作為參比，在365 nm紫外光激發(fā)下測得的ETAM-GQDs的量子產(chǎn)率為38.2%。除此之外，活體細胞HL7702和ETAM-GQDs共培養(yǎng)后，通過熒光成像實驗證實了ETAM-GQDs可以作為有效的生物成像劑。

關(guān)鍵詞：石墨烯；量子點；光致發(fā)光；生物成像

1前言

具有光致發(fā)光特性的碳材料量子點，由于其低成本、低毒性、良好的化學(xué)惰性和生物相容性，近年來吸引了越來越多的研究興趣[1-10]。作為傳統(tǒng)半導(dǎo)體量子點的替代材料，基于碳材料的量子點具有廣闊的應(yīng)用，其中包括生物成像和生物標記[4-12]、熒光墨水[13]、光催化[14-15]、光致發(fā)光二極管以及太陽能電池等應(yīng)用[16-18]。從形貌和尺寸來看，基于碳材料量子點可分為兩大類：碳量子點和石墨烯量子點。碳量子點(CDs)通常被定義為尺寸小于10 nm的類球形碳顆粒[3-9，19]；而石墨烯量子點(GQDs)則具有單層或多層石墨烯片狀結(jié)構(gòu)，并且其平面直徑往往小于100 nm[3-9，20-21]。由于顯著的量子限域效應(yīng)和邊界效應(yīng)，石墨烯量子點具有許多有趣的特性并且近年來受到了越來越多的研究[3-9，20-47]。到目前為止，合成石墨烯量子點的方法包括水熱/溶劑熱切割法[22]、電化學(xué)氧化法[12，23]、等離子氧處理法[25]、化學(xué)全合成[26]、酸解法和氧化分解法等[3-9，24，27]。為了改善石墨烯量子點的表面化學(xué)特性[26-30，46]，化學(xué)前驅(qū)體常常被用來表面修飾和引入其他元素的摻雜。2011年李等[29]報道了石墨烯量子點與低聚端基胺聚乙二醇反應(yīng)得到藍色熒光的修飾石墨烯量子點，其尺寸為5～19 nm，量子產(chǎn)率為7.4%。同年，Muellen等[31]利用多環(huán)芳烴作為前驅(qū)體(Hexa-Peri-Hexabenzocoronene，HBC)合成了多色碟狀石墨烯量子點。盡管這些方法都能得到修飾石墨烯量子點，但是由于這些分步合成修飾法多使用昂貴的化學(xué)前驅(qū)體和復(fù)雜的操作流程，因而難以直接應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)[2-9，21，29-30]。因此，一種能夠快速合成高量子產(chǎn)率的修飾石墨烯量子點有待研究發(fā)展。

本文報道以檸檬酸作為碳源、甘氨酸作為橋聯(lián)劑、通過乙醇胺/去離子水共溶劑水熱法，一步合成乙醇胺修飾的石墨烯量子點(ETAM-GQDs)。

2實驗

2.1材料

檸檬酸(C6H8O7·H2O，99.5%)，甘氨酸(99.5%)，2-氨基乙醇(乙醇胺，ETAM，99.0%)，所有化學(xué)品使用前未經(jīng)進一步純化。

2.2石墨烯量子點合成

ETAM-GQDs是將混合碳源(檸檬酸和甘氨酸)和表面鈍化劑(乙醇胺)作為前驅(qū)體，一步水熱處理而合成的。在一個典型的合成過程中，將1.0 g(4.8毫摩爾)檸檬酸一水合物和0.3 g(4.0毫摩爾)甘氨酸溶解在5 ml 2-氨基乙醇(ETAM)和水的混合溶劑(4∶1，體積比)并超聲30 min。然后將得到的濃混合液在特氟隆高壓釜中進行水熱加熱200 ℃、5 h。得到的深綠色粗產(chǎn)物用甲醇/丙酮作為洗脫劑，利用柱色譜純化得到了乙醇胺修飾石墨烯量子點(ETAM-GQDs)。同時，也合成了參比石墨烯量子點(CAG-GQDs)，即用純的去離子水為溶劑不添加乙醇胺，其他步驟相同[48]。

2.3細胞毒性測試

HL7702細胞在5×105細胞/皿(Corning公司430166)接種。經(jīng)6 h培養(yǎng)將細胞附著在培養(yǎng)皿后，將基質(zhì)換成不同濃度的ETAM-GQDs(或CAG-GQDs)的DMEM溶液，并以無GQDs的DMEM培養(yǎng)基作為對照。孵育24 h后，用PBS緩沖溶液洗滌三次以除去多余的GQDs。熒光成像使用蔡司LSM710共聚焦顯微鏡，并選用405 nm激光激發(fā)。不同的激發(fā)波長熒光成像是通過使用不同的濾光片進行的。

3結(jié)果與討論

3.1石墨烯量子點的合成與表征

石墨烯量子點合成過程如圖1所示。使用乙醇胺作為共溶劑，并同時作為表面修飾的前驅(qū)體，通過高溫條件下與羧基形成的酰胺鍵形式構(gòu)建起聚合物框架，后者在高溫條件下脫水脫羧碳化，最終形成石墨烯骨架[32，35]。

圖1　ETAM-GQDs合成過程Fig.1　Schematic illustration of a synthetic route of ETAM-GQDs involving condensation to carbonization

ETAM-GQDs的形貌通過原子力顯微鏡(AFM)來表征。如圖2所示，ETAM-GQDs的直徑分布在20～40 nm的范圍，并且其平均高度為1.6 nm，這些參數(shù)與其他方法制備的GQDs類似[20，26]。由于拉曼光譜能為碳納米材料的電子結(jié)構(gòu)提供靈敏而有價值的信息，因而使用拉曼光譜進一步探究了石墨烯量子點的結(jié)構(gòu)[53]。在圖2d拉曼光譜中，位于1 380 cm-1和1 585 cm-1的兩個寬峰分別屬于sp3碳原子振動的D帶與sp2碳原子的G帶，證實了石墨烯量子點的結(jié)構(gòu)中sp2碳原子和sp3碳原子共存[34]。

為了研究ETAM-GQDs表面官能團，對其進行X射線光電子能譜(XPS能譜)表征。如圖2e所示，ETAM-GQDs主要由碳、氧、氮3種元素構(gòu)成，并且摩爾比為10∶3∶1。高分辨率的C1s XPS光譜圖顯示3種不同化學(xué)環(huán)境的碳分別在284.6，285.8和287.7電子伏特有峰值，而這些峰值歸屬于C=C，C-O/C-N，C=O，證明了羧酸、羥基和酰胺基團的存在，證實了ETAM成功修飾了石墨烯量子點。

圖2　ETAM-GQDs的AFM圖(a)以及半徑分布(b)和高度分布(c)， ETAM-GQDs的Raman譜(d)， ETAM-GQDs的XPS譜圖(e)Fig.2　AFM height image of ETAM-GQDs together with the diameter(a) ，height (b) and distributions(c)， Raman spectrum of ETAM-GQDs(d)， Survey XPS spectrum of ETAM-GQDs(e)

3.2光學(xué)性質(zhì)

圖3顯示了ETAM-GQDs紫外可見(UV-vis)光譜和熒光發(fā)射(PL)譜圖。ETAM-GQDs在甲醇中的UV-vis吸收光譜中，吸收峰在312 nm左右并且出現(xiàn)兩個弱肩峰(278 nm和340 nm)。如圖3內(nèi)嵌圖所示，即使在非常低的濃度，ETAM-GQDs在365 nm的紫外光下仍然顯示明亮的藍光(0.5 mg·mL-1)。ETAM-GQDs的光致發(fā)光光譜也顯示為寬峰，并依賴于激發(fā)波長而位移。有趣的是，當激發(fā)波長由300 nm 逐漸增加至440 nm時，熒光發(fā)射峰也紅移到較長波長區(qū)，并在400 nm激發(fā)獲得了強度最高的發(fā)光峰(見圖3)。這個最強發(fā)光峰較其它方法制備的小尺寸GQDs位于更長波長，可以解釋為不同尺寸的納米顆粒會導(dǎo)致不同態(tài)的分布以及GQDs的帶隙[48]。而ETAM-GQDs在不同激發(fā)波長下顯示不同發(fā)光性質(zhì)的行為可以應(yīng)用在多色成像中，特別是長波長熒光探針，將在下文有所討論。

圖3　ETAM-GQDs的紫外可見光譜和熒光發(fā)射譜圖Fig.3　 UV-vis absorption and PL spectra of ETAM-GQDs

ETAM-GQDs在365 nm的熒光量子產(chǎn)率是通過以硫酸奎寧作為參比，用相對量子產(chǎn)率計算法測定的，為38.2%[32]。 ETAM-GQDs的高熒光量子產(chǎn)率來源于表面態(tài)的增加以及氮元素的摻雜，因為這有利于增強激發(fā)態(tài)的熒光回遷[41，48]。為了進一步證實這一觀點，通過相同的水熱合成路線得到了一種不含乙醇胺修飾的GQDs(簡稱CAG-GQDs)作為對照。而不修飾乙醇胺的參比石墨烯量子點CAG-GQDs的熒光量子產(chǎn)率在相同的條件下測得為27.0%，這比ETAM-GQDs的38.2%低了約40%。這一結(jié)果表明，ETAM的修飾以及共摻雜氮和氧的表面鈍化對其高熒光量子產(chǎn)率是至關(guān)重要的。

3.3生物成像

盡管乙醇胺修飾石墨烯量子點在體外顯示出有趣的熒光特性，然而其能否在活體細胞中依然有顯著的熒光活性仍然不得而知，特別是考慮到細胞內(nèi)復(fù)雜的生物化學(xué)環(huán)境以及潛在活性的水解氧化酶體系[3-9]。因此，為了探索ETAM-GQDs能否在活體細胞中生物成像的應(yīng)用潛力，實驗使用了人肝細胞(HL7702細胞)在不同濃度ETAM-GQDs下進行了測試[39-40]。如圖4所示，當使用不同濃度的ETAM-GQDs在405 nm激光激發(fā)下，熒光強度隨量子點濃度的提高而顯著提高。在濃度為2 mg/mL 時，孵育ETAM-GQDs的 HL7702細胞顯示清晰的細胞結(jié)構(gòu)。

圖4　不同濃度的ETAM-GQDs條件下培養(yǎng)的細胞成像圖Fig.4　Fluorescent images of HL7702 cells incubated without/with ETAM-GQDs at different concentrations

然而，當HL7702細胞在與對照石墨烯量子點CAG-GQDs培養(yǎng)后，幾乎不顯示任何可見熒光(如圖5)。即便是HL7702細胞在CAG-GQDs的高濃度(2 mg/mL)中培養(yǎng)，其他條件與乙醇胺修飾石墨烯量子點一致，仍然未見明顯熒光?？紤]到對照樣品CAG-GQDs量子產(chǎn)率比ETAM-GQDs低得多，并且表面化學(xué)環(huán)境也有所不同，很可能導(dǎo)致其在細胞體內(nèi)不產(chǎn)生熒光。

圖5　ETAM-GQDs和CAG-GQDs條件下培養(yǎng)的細胞成像圖Fig.5　Fluorescent images of cells incubated with ETAM-GQDs or CAG-GQDs (both at 2 mg/mL) for 24 h

正如之前討論，ETAM-GQDs發(fā)光峰值在不同的激發(fā)波長下有所差異，因而有潛力應(yīng)用于多色生物成像技術(shù)。同時，使用HL7702細胞作為研究載體，在幾個不同的激發(fā)波長下激發(fā)，研究ETAM-GQDs的活體熒光特性。如圖6所示，不同的濾光調(diào)控的激發(fā)波長下，ETAM-GQDs的熒光圖像顯示出不同發(fā)光特性，說明了ETAM-GQDs對激發(fā)波長依賴性的光致發(fā)光行為[42]。其中，用ETAM-GQDs培養(yǎng)的細胞在330～385 nm的濾光片顯示出明顯的藍色熒光信號，而這種現(xiàn)象是與熒光光譜所得到的結(jié)果一致。出人意料的是，熒光信號在530～550 nm的濾光片下也很強，可能由于黃色熒光在這種情況下容易被觀察。但是，在460～495 nm和650～725 nm的濾光片下，細胞的熒光信號變得幾乎不可見，這也和熒光發(fā)射光譜十分一致。盡管這種光致發(fā)光行為的詳盡機理仍不清楚，但是活細胞的熒光穩(wěn)定性仍然使ETAM-GQDs具有體外生物測試和醫(yī)學(xué)成像的潛在應(yīng)用。

圖6　在ETAM-GQDs培養(yǎng)下的多色細胞成像圖，圖中各濾光片對應(yīng)波段分別為：WU：330～385nm;WIG:530～550nm;WIBA:460～495nm;CY5:650～725nm。Fig.6　Fluorescent images of HL7702 cells incubated with ETAM-GQDs (2 mg/mL) taken with different filters.Including WU(transmission range:330～385nm),WIBA(460～495nm)and CY5(650～725nm).

4結(jié)論

(1)合成了新型乙醇胺修飾的石墨烯量子點。通過AFM表征，確定出所制備ETAM-GQDs的直徑分布在20～40 nm的范圍，且平均直徑為～30 nm，平均高度為～1.6 nm。同時通過XPS證明了乙醇胺成功地修飾在石墨烯量子點上。

(2)對ETAM-GQDs進行了紫外可見光譜等光學(xué)表征，在365 nm 激光激發(fā)下，產(chǎn)物顯示出明亮的藍色，而熒光發(fā)射光譜也進一步顯示了產(chǎn)物的熒光特性。另外通過合成參比石墨烯量子點，發(fā)現(xiàn)了乙醇胺修飾后量子產(chǎn)率提高了約40%，達到了38.2%(以硫酸奎寧為基準)。

(3)通過將產(chǎn)物與HL7702細胞共培養(yǎng)，研究了ETAM-GQDs和對照CAG-GQDs在活體細胞的生物成像，并且對ETAM-GQDs培養(yǎng)的HL7702細胞進行了多色成像研究，表明乙醇胺表面修飾后的ETAM-GQDs具有較好的生物相容性和熒光活性。這些結(jié)果將有利于未來碳基量子點的研究和生物應(yīng)用。

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(編輯王方)

One-Pot Synthesis and Bioimaging Application ofEthanolamine-Grafted Graphene Quantum Dots

ZENG Minxiang，CHEN Xiang，XIE Yuqing，GUAN Jian，ZHEN Jieming，

ZHU Xianjun，YANG Shangfeng

(CAS Key Laboratory of Materials for Energy Conversion，Hefei National Laboratory for Physical Sciences at Microscale，

University of Science and Technology of China (USTC)，Hefei 230026，China)

Abstract：Ethanolamine-grafted graphene quantum dots (ETAM-GQDs) as a novel type of carbon-based quantum dots have been successfully synthesized via a facile one-pot hydrothermal approach，and show potential application in bioimaging.The hydrothermal synthesis of ETAM-GQDs was accomplished by introducing ethanolamine (ETAM) as the co-solvent blending deionized water while citric acid and glycine are used as the main carbon source and bridge for condensation respectively. The size distribution of ETAM-GQDs was determined by AFM and TEM. The photoluminescent (PL) quantum yield of ETAM-GQDs was measured to be 38.2% under 365 nm light excitation by using quinine sulphate as a standard. The biocompatibility of ETAM-GQDs evaluated by MTT assay indicated the low toxicity of ETAM-GQDs at concentrations below 1 mg/mL. Fluorescent imaging of living HL7702 cells incubated with ETAM-GQDs demonstrated that ETAM-GQDs can be applied as an effective bioimaging agent.

Key words：graphene；quantum dots；photoluminescence；bioimaging

中圖分類號：O69

文獻標識碼：A

文章編號：1674-3962(2015)11-0841-06

青年園地

收稿日期：2015-07-15

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(21371164)

第一作者：曾敏翔，男，1992年生，博士研究生

通訊作者：楊上峰，男，1975年生，教授，博士生導(dǎo)師，Email:sfyang@ustc.edu.cn

DOI:10.7502/j.issn.1674-3962.2015.11.06