骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控肝星狀細(xì)胞治療肝纖維化機(jī)制的研究進(jìn)展

陳玲肖（綜述）　宋水川　馬炬明（審校）

·綜述·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控肝星狀細(xì)胞治療肝纖維化機(jī)制的研究進(jìn)展

陳玲肖（綜述）宋水川馬炬明（審校）

肝纖維化不是一個獨(dú)立的疾病，是各種致病因子導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織的異常增生，引起肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積的病理過程，較多慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化。常規(guī)的內(nèi)科保肝治療效果不佳，病死率較高。目前原位肝移植仍是治療終末期肝病最有效的措施，但由于缺乏供體、費(fèi)用昂貴、并發(fā)癥多、免疫排斥等因素，使這一治療方法較難得到推廣。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有多向分化的潛能，多項研究表明，BMSCs能有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化，對肝組織的損傷和修復(fù)有顯著作用。

1　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性及鑒定

目前認(rèn)為，BMSCs治療肝纖維化的可能機(jī)制是：（1）促進(jìn)正常肝細(xì)胞再生。（2）BMSCs抑制肝星狀細(xì)胞（HSCs）的活化并促使其凋亡。（3）BMSCs分泌的細(xì)胞因子/生長因子的作用。（4）BMSCs促進(jìn)ECM的降解作用。（5）BMSCs激活并分化成肝卵原細(xì)胞，促肝細(xì)胞再生。HSCs的活化和增殖是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［1］?？刂艸SCs的激活和增殖以逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程是抗肝纖維化研究的重點之一。

BMSCs是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)臈l件下，源于中胚層的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以跨越胚層向內(nèi)胚層及外胚層的組織、細(xì)胞分化，比如分化為肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞等［2，3］。研究者稱之為“可塑性”或“橫向分化”。

到目前為止，BMSCs無特定的表面標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs能 夠 表 達(dá)CD105（SH2）、CD73（SH3/4）、CD44、CD90（Thy-1）、CD71、CD106等，但不表達(dá)造血干細(xì)胞的標(biāo)志如CD45，CD34，CD14，和CD11，也不表達(dá)共刺激分子CD80，CD86，和CD40［4］。另外BMSCs還能分泌多種細(xì)胞因子及受體、趨化因子、粘附分子等。為規(guī)范MSCs的研究，2006年國際細(xì)胞移植治療學(xué)會在其官方期刊 Cytotherapy上對MSCs的鑒定提出了三條基本標(biāo)準(zhǔn)［5］：首先在體外正常培養(yǎng)條件下能夠快速貼附到塑料培養(yǎng)皿底；其次細(xì)胞表面標(biāo)志組合為CD14-CD11b-CD19-CD79α-CD34-CD45-HLA-DR-CD73+CD90+CD105+；再次可以向中胚層方向成骨、脂肪和軟骨誘導(dǎo)分化。

2　肝星狀細(xì)胞致肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞分子機(jī)制

肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的直接原因是肝臟受到長期反復(fù)刺激，導(dǎo)致肝纖維化的主要成分-細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成過多，降解減少，堆積增加。目前，國內(nèi)外主流觀點認(rèn)為，HSCs是受損肝臟中過多ECM的主要來源?？刂艸SCs的激活和增殖以逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程是抗肝纖維化研究的重點之一。

HSCs位于肝竇Disse間隙，約占肝臟細(xì)胞總數(shù)的13%，與肝細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸。HSCs正常情況下處于靜息狀態(tài)，主要功能是參與維生素A的代謝和儲存脂肪。其最大的形態(tài)學(xué)特征主要表現(xiàn)為不規(guī)則的形態(tài)，胞體可呈不規(guī)則多邊形，卵圓形或星形，胞體通常延伸出各種不同形狀的胞突包繞于肝血竇，鄰近的HSCs主要也是由延伸出來的胞突相接觸聯(lián)系［6］。1985年Friedman等首次報道這種貯脂細(xì)胞是生成膠原的主要細(xì)胞，之后大量研究開始關(guān)注其在肝纖維化進(jìn)程中的作用，并取較很大進(jìn)展，調(diào)控HSCs活化的關(guān)鍵信號通路基本闡明。

研究發(fā)現(xiàn)，在病毒、酒精等慢性損傷因素作用下，肝細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等通過旁分泌途徑，激活的HSCs也可通過自分泌途徑，產(chǎn)生TGF-β1、血小板衍生生長因子（PDGF）等多種細(xì)胞因子，使靜止的HSCs被激活，轉(zhuǎn)變成肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，表達(dá)α-平滑肌動蛋白（α-SMA）。此時，肝星狀細(xì)胞大量增殖，凋亡減少，合成大量ECM，同時ECM降解減少，以致其在肝內(nèi)大量沉積，肝纖維化逐漸形成。

3　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控肝星狀細(xì)胞治療肝纖維化的機(jī)制

3.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制肝星狀細(xì)胞的活化并促使其凋亡 HSCs是正常肝和纖維化時合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，HSCs的過度激活導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。近來不斷有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs與HSCs體外聯(lián)合培養(yǎng)后，BMSCs可以抑制HSCs的活化，并促進(jìn)其凋亡，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而緩解肝纖維化。

趙東長等［7］利用建立BMSCs與HSCs非直接接觸的聯(lián)合培養(yǎng)體系進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，結(jié)果顯示HSCs的增殖及α-SMA的表達(dá)均較對照組明顯減少，表明BMSCs可以顯著抑制HSCs的活化及增殖。Su SB等［8］研究表明，體外HSCs與MSCs聯(lián)合培養(yǎng)24 h后，與對照組比較，HSCs表現(xiàn)明顯增殖抑制，且呈現(xiàn)時間依賴性。MSCs可阻滯HSCs由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，使G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，抑制HSCs的增殖并促進(jìn)其凋亡。Parekkadan等［9］通過細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)BMSCs可以使HSCs細(xì)胞周期停滯于G0/G1期， 從而抑制HSCs生長， 促進(jìn)活化狀態(tài)的HSCs凋亡，同時減少聯(lián)合培養(yǎng)體系中膠原的沉積。楊文等［10］發(fā)現(xiàn)在BMSCs與HSCs聯(lián)合培養(yǎng)組中，隨著培養(yǎng)的時間延長，BMSCs對HSCs的促凋亡作用越來越明顯，呈時間依賴性增加，用SYBR熒光實時定量RT-PCR法檢測死亡受體5mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著聯(lián)合培養(yǎng)時間的延長，聯(lián)合培養(yǎng)組中HSCs的死亡受體5mRNA合成呈遞增趨勢，較對照組顯著增多，進(jìn)而推斷BMSCs能促進(jìn)HSCs的凋亡，上調(diào)死亡受體5mRNA的表達(dá)。Lin N等［11］通過將BMSCs經(jīng)尾靜脈注射入CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，發(fā)現(xiàn)BMSCs在體內(nèi)也能夠促進(jìn)HSCs發(fā)生凋亡。

3.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過旁分泌機(jī)制和信號通路傳導(dǎo)作用于HSCs 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子， 如肝細(xì)胞生長因子（HGF）、神經(jīng)細(xì)胞生長因子（NGF）、胰島素樣生長因子1（IGF-1）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）和白介素、干細(xì)胞因子等。最近的相關(guān)研究表明，BMSCs主要是通過旁分泌某些細(xì)胞因子和信號通路傳導(dǎo)作用于HSCs。

Parekkadan 等［9］通過細(xì)胞共同培養(yǎng)方法，發(fā)現(xiàn)BMSCs可分泌白介素-10（IL-10）、TNF-α和HGF，通過旁分泌方式抑制HSCs增殖和膠原合成，促進(jìn)活化狀態(tài)的HSCs凋亡。中和IL-10和TNF-α能阻斷BMSCs的抑制HSCs增殖和膠原合成的作用；中和HGF能阻斷BMSCs的促HSCs凋亡的作用。同時活化的HSCs可分泌IL-6促進(jìn)BMSCs IL-10的分泌。Chen GZ等［12］采用將鼠MSCs與HSCs非接觸共同培養(yǎng)的方法，證實MSCs可以不通過直接接觸而對HSCs的激活產(chǎn)生抑制作用，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測MSCs與HSCs聯(lián)合培養(yǎng)的上清液中HGF的濃度上升。將c-met多克隆抗體預(yù)先封閉HSCs表面的c-met受體，再與MSCs聯(lián)合培養(yǎng)，結(jié)果顯示MSCs失去對HSCs的上述作用，由此看出MSCs抑制HSCs的活化、增殖，促進(jìn)HSCs的凋亡可能是通過旁分泌HGF，經(jīng)HGF/c-met途徑發(fā)揮作用的。史立君等［13］研究發(fā)現(xiàn)BMSC可分泌NGF、HGF、TGF-β等細(xì)胞因子，而活化的HSCs能夠表達(dá)NGF受體p75，NGF與p75結(jié)合后促進(jìn)了HSCs的凋亡，其可能的途徑是NF-KB和JNK途徑，即NGF與p75結(jié)合后激活JNK，阻斷ERK的磷酸化，同時抑制NF-KB的活化，從而起到抑制HSCs增殖，促進(jìn)HSCs凋亡的作用。張君紅等［14］通過建立BMSCs與HSCs細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)HSCs中死亡受體5、caspase-8mRNA及蛋白的表達(dá)較對照組均明顯增高。用慢病毒介導(dǎo)的Sh-RNA將BMSCs中的HGF基因沉默后觀察蛋白的表達(dá)及凋亡的變化，發(fā)現(xiàn)HGF-ShRNA干擾組中的凋亡率及兩種蛋白的表達(dá)較聯(lián)合培養(yǎng)組低，但高于對照組，表明BMSCs旁分泌的HGF能上調(diào)HSCs中死亡受體5及caspase-8的表達(dá)，促進(jìn)HSCs的凋亡，可能是BMSCs抗肝纖維化作用的分子機(jī)制之一，在該聯(lián)合培養(yǎng)體系中，尚有其他許多因子與HSCs的凋亡有關(guān)。

4　小結(jié)與展望

BMSCs為肝纖維化的治療方面開辟了一個新的領(lǐng)域。且BMSCs具有易采集，能體外大量擴(kuò)增，可自我更新并向多種細(xì)胞類型分化，體積較小利于進(jìn)入肝實質(zhì)區(qū)，自體移植而無免疫排斥，不涉及倫理道德問題等被認(rèn)為是最具治療潛力的供體細(xì)胞［15］。

雖然BMSCs在治療肝纖維化方面有較多的實驗研究，但廣泛應(yīng)用于臨床尚存在一系列問題。首先，BMSCs治療肝纖維化的具體機(jī)制還不甚明確。BMSCs對HSCs活化、增殖以及凋亡等調(diào)控作用目前主要還停留在體外細(xì)胞相互作用的研究上，而對于移植入體內(nèi)的BMSCs改善肝臟纖維化狀態(tài)是否也通過調(diào)控HSCs活性以及如何調(diào)控等問題，有待進(jìn)一步研究。其次，BMSCs治療肝纖維化的效果尚未確定，甚至可能加重肝纖維化的形成。Carvalho等［16］用MSCs治療嚴(yán)重肝損害模型的大鼠并與對照組相比較，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)肝功能明顯改善。而DiBonzo等［17］認(rèn)為，只有極少量MSCs分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞，且MSCs移植后會出現(xiàn)相當(dāng)數(shù)量的成肌纖維樣細(xì)胞，而這些成肌纖維樣細(xì)胞正是引起纖維化基質(zhì)沉積的主要細(xì)胞來源。有研究表明，BMSCs移植的首要潛在危險因素是其在體外表現(xiàn)為抗癌作用， 而在體內(nèi)卻會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長；BMSCs體內(nèi)數(shù)量少，體外分離、純化及擴(kuò)增方法還不夠完善。

1Friedman SL. Hepatic stellate cells： protean， multifunctional， and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev，2008，88（1）：125～172.

2Terai S，Sakaida I，Yamamoto N，et al. An in vivo model for monitoring trans-differentiation of bone marrow cells into functional hepatocytes. J Biochem. 2003，134（4）：551～558.

3Neuhuber B， Gallo G， Howard L， et al. Reevaluation of in vitro differentiation protocols for bone marrow stromal cells：disruption of actin cytoskeleton induces rapid morphological changes and mimics neuronal phenotype. J Neurosci Res.2004，77（2）：192～204.

4Gisetle Chamberlain， James Fox.Concise review： Mesenchymal stem cells：their phenotype， differentiation capacity， immunological features，and potential for homing.Stem Cells，2007，25（11）：2739～2749.

5Dominici M， Le Blanc K， Mueller I， et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy，2006，8：315～317.

6Atzori L， Poli QPerra A. Hepatic stellate cell： a star cell in the liver. Int J Biochem CellBiol，2009，41（8-9）：1639～1642.

7趙東長， 陳蕊， 余偉華， 等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制肝星狀細(xì)胞增殖與活化的體外研究.中國病理生理雜志.2005，21（6）：1139～1142.

8Su SB， Jiang HX， Wang DX， et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modulate the expression of RhoA and P27 in hepatic stellate cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2009， 17（32）： 3283～3291.

9Parekkadan B， van Poll D， Megeed Z， et al. Immunomodulation of activated hepatic stellate cells by mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun，2007，363（2）：247～252.

10楊文，覃山羽，姜海行，等.應(yīng)用SYBR熒光實時定量RT-PCR法檢測BMSCs誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞中DR5mRNA表達(dá).蛇志，2012，24（1）：1～4.

11Lin N， Xie SJ， Pan WD， et al. Rat bone marrow mesenchymal stem cells induce hepatic stellate cells apoptosis in vivo.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu，2010，14（10）： 1769～1774.

12Chen GZ， Jiang HX， Lu ZF， et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modulate cell proliferation and apoptosis and RohA expression in rat hepatic stellate cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi，2010，18（16）：1643～1649.

13史立軍， 王菁華， 徐克達(dá)， 等. 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對大鼠肝纖維化細(xì)胞凋亡的影響.中國生物制品學(xué)雜志，2008，21（11）：929～932.

14張君紅，姜海行，孟云超，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌HGF上調(diào)肝星狀細(xì)胞DR5及caspase-8的表達(dá).基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32（7）：804～808.

15Ong SY， Dai H， Leong KW. Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stern cells in pellet culture.Biomatefial，2006， 27（10）：4087～4097.

16Carvalho AB， Quintanilha LF， Dias JV， et al. Bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells do not reduce fibrosis or improve function in a rat model of severe chronic liver injury. Stem Cells， 2008， 26（5）：1307～1314.

17Di Bonzo LV， Ferrero I， Cravan zola C， et al. Human mesenchymal stem cells as a two-edged sword in hepatic regenerative medicine：engraftment and hepatocyte differentiation versus profibrogenic potential. Gut， 2008， 57（2）：223～231.

浙江省年度重大科技專項計劃項目（2011C130291-12011）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)（陳玲肖）310013 杭州中國人民解放軍第117醫(yī)院消化內(nèi)科（宋水川 馬炬明）