人臍帶組織間充質(zhì)干細胞對小鼠腫瘤的趨化作用

房敬超，張曉龍，張晴，曹蕾，姜愛娜，李茜(協(xié)和干細胞基因工程有限公司，天津300384;中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液病醫(yī)院血液學研究所，實驗血液學國家重點實驗室)

人臍帶組織間充質(zhì)干細胞對小鼠腫瘤的趨化作用

房敬超1，張曉龍2，張晴2，曹蕾1，姜愛娜1，李茜1
(1協(xié)和干細胞基因工程有限公司，天津300384;2中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液病醫(yī)院血液學研究所，實驗血液學國家重點實驗室)

摘要:目的觀察人臍帶組織間充質(zhì)干細胞(MSCs)對小鼠B系惡性淋巴瘤和肝癌的趨化作用。方法通過酶切、連接等方法構(gòu)建pLenti-fLuc慢病毒表達載體，利用293T細胞包裝慢病毒顆粒，并感染人臍帶組織華通氏膠來源的MSCs(WJ-MSCs)，使其表達螢火蟲熒光素酶(fLuc)。分別于NOD/SCID小鼠中建立BJAB淋巴瘤細胞皮下移植模型及BALB/c裸鼠中建立HepG2肝癌原位移植瘤模型，經(jīng)尾靜脈將MSCs-fLuc注射至荷瘤小鼠體內(nèi)，采用體內(nèi)生物發(fā)光成像系統(tǒng)觀察MSCs-fLuc向腫瘤部位的遷移情況。結(jié)果成功構(gòu)建慢病毒表達載體pLenti-fLuc，且經(jīng)慢病毒感染可在WJ-MSCs中穩(wěn)定表達。成功建立BJAB淋巴瘤細胞皮下移植瘤模型，MSCs-fLuc經(jīng)小鼠尾靜脈注射24 h后選擇性地定位于腫瘤部位。成功建立BALB/c裸鼠的HepG2肝癌皮下原位移植瘤模型，MSCs-fLuc經(jīng)尾靜脈注射2 d后遷移并聚集于肝臟。結(jié)論WJ-MSCs具有向小鼠淋巴瘤和肝癌歸巢的能力，此為以MSCs為載體的腫瘤靶向治療提供了實驗基礎。

關(guān)鍵詞:淋巴瘤;肝腫瘤;間充質(zhì)干細胞;生物發(fā)光成像;趨化作用;小鼠

間充質(zhì)干細胞(MSCs)為一群異質(zhì)性的非造血干細胞，具有高度增殖活性和多向分化潛能，廣泛分布于全身多種組織［1～6］。MSCs具有低免疫源性、分離純化方便、易于基因改造以及向腫瘤部位歸巢等特點［7～9］，已成為腫瘤靶向治療的理想載體?；铙w動物體內(nèi)光學成像系統(tǒng)(IVIS)通過靈敏的光學檢測儀器可以直接監(jiān)控生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為，相比傳統(tǒng)的動物實驗所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。為了研究MSCs在體內(nèi)對腫瘤的趨化作用，2013年6月～2014年9月，我們用螢火蟲熒光素酶(fLuc)標記了人臍帶華通氏膠來源的間充質(zhì)干細胞(WJMSCs)，并觀察其對小鼠B系惡性淋巴瘤和肝癌的趨化作用。

1　材料與方法

1.1材料pGL3-basic載體、慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP及包裝載體pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G由本室保存;大腸桿菌DH5α購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2WJ-MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定從手術(shù)臺上取下的人臍帶在24 h內(nèi)進行處理，用含雙抗的PBS沖洗臍帶，將其剪成1 cm長的小塊，沖洗干凈;剝離臍帶動靜脈血管壁，取華通氏膠部分，剪碎至0.5 cm3大小，依次擺放于預先濕潤的T-75塑料培養(yǎng)瓶中倒置培養(yǎng); 4～8 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，次日添加1 mL 含10%FBS及2 mmol/L L-谷氨酰胺的DF-12培養(yǎng)基，連續(xù)添加3 d，第4天全量換液，以后每周換液兩次;培養(yǎng)10～14 d后，去除組織塊，用含0.125%胰酶及0.01%EDTA的細胞消化液消化細胞，進行初次原瓶傳代，待細胞長至60%～70%融合時，二次傳代(3×103/cm2)或凍存。取第3～5代的WJMSCs用于實驗。收集對數(shù)生長期的WJ-MSCs，冷PBS洗滌3次，將細胞分別重懸于20 μL直標抗體CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE中，4℃孵育1 h，PBS洗滌3次后重懸于400 μL PBS中，流式細胞儀檢測WJ-MSCs相應表型的陽性率。

1.3慢病毒表達載體pLenti-fLuc的構(gòu)建按照質(zhì)粒小提試劑盒(DP103-03，天根生化科技有限公司)操作步驟，利用Nhe I、BamH I雙酶切慢病毒表達載體pLenti-R和含fLuc報告基因的載體pGL3-basic。1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，并用瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒純化回收得到載體大片段和編碼熒光素酶的小片段。用T4快速連接酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接兩片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)菌，挑取單克隆于2-YT(含氨芐青霉素100 μg/mL)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h。小提質(zhì)粒，用Nhe I和BamH I雙酶切鑒定，并于－80℃凍存鑒定正確的克隆。

1.4慢病毒的包裝及感染W(wǎng)J-MSCs按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(DP117，天根生化科技有限公司)的操作步驟同時提取3種慢病毒包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G以及慢病毒表達載體pLenti-fLuc。胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞，按2×106/mL的細胞密度接種5 mL至10 cm培養(yǎng)板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按照LipofectaminTM2000操作步驟，將4種質(zhì)粒pPACKH1-GAG(6 μg)、pPACKH1-REV(2 μg)、pVSV-G(2 μg)以及pLenti-fLuc(2 μg)共同轉(zhuǎn)染至293T細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集293T細胞培養(yǎng)上清，4℃離心(4 000 r/min，10 min)去除細胞碎片，并用0.45 μm濾器過濾。病毒上清直接用于感染細胞或－80℃中保存。取第3～5代的WJ-MSCs 按8×103個/cm2的密度接種于T-75培養(yǎng)瓶中。次日，將WJ-MSCs培養(yǎng)基換為含病毒上清的DF-12培養(yǎng)基(按MOI=8將病毒上清與新鮮含10% FBS的DF-12培養(yǎng)基混合成8 mL，同時加入polybrene，終濃度為8 μg/mL)，12 h后終止感染。WJ-MSCs經(jīng)慢病毒感染后第4天，熒光顯微鏡下觀察CopGFP熒光，0.125%胰酶消化后收集細胞用于體內(nèi)實驗，或液氮凍存。

1.5MSC-fLuc中報告基因fLuc的表達檢測用含fLuc報告基因的慢病毒顆粒按照MOI=8感染W(wǎng)JMSCs，使其穩(wěn)定表達fLuc。取24孔板1塊，分別加入5×102、1×103、5×103、1×104、5×104、1×105、5 ×105個細胞，并設PBS空白對照。每孔加入終濃度為150 μg/mL的D-luciferin，30 s后在IVIS上檢測生物發(fā)光情況。

1.6荷瘤小鼠模型的建立

1.6.1BJAB移植瘤模型的建立選用雌性6周齡NOD/SCID小鼠(中國協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物中心提供) 6只，體質(zhì)量18～20 g，于SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，并對小鼠行γ射線(260 cGy/只)照射。BJAB細胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，收集對數(shù)生長期的BJAB細胞，冷PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度為2.5×107/mL，于小鼠右前肢根部背側(cè)皮下接種BJAB細胞，每只小鼠接種200 μL，待腫瘤生長至200～300 mm3時進行實驗。

1.6.2HepG2肝癌皮下原位移植瘤模型的建立選用雌性5周齡BALB/c裸鼠(中國協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物中心提供) 15只，體質(zhì)量18～20 g，于SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)。取其中5只皮下接種前5 h對小鼠行γ射線照射。HepG2肝癌細胞培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM完全培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的HepG2肝癌細胞經(jīng)胰酶消化后用冷PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度為2.5×107/mL。用帶21 G針頭的1 mL注射器于小鼠右后肢根部背側(cè)皮下接種HepG2細胞，每只小鼠接種200 μL。接種后約2周左右腫瘤成長至1 cm3。原位移植參照文獻［10］進行，脫頸處死皮下移植瘤小鼠，無菌條件下取魚肉狀瘤組織，放入含有慶大霉素的生理鹽水中漂洗，并修剪成1～2 mm3大小備用。另取10只使用2%戊巴比妥鈉以100 mg/kg的劑量行腹腔麻醉，常規(guī)消毒后沿劍突下腹中線剪開1～2 cm，擠出肝臟，用手術(shù)刀切一小口，將瘤塊用眼科鑷放入切口約3 mm深，用生理鹽水浸潤的紗布止血1 min以防止瘤塊脫落?？p合切口后用紅霉素眼膏涂于切口處預防感染。術(shù)后2周，脫頸處死小鼠，取肝臟、肺、脾、腎進行病理學檢查，確定原位模型是否建立成功及有無轉(zhuǎn)移。

1.7MSCs-fLuc對腫瘤的趨化作用觀察待BJAB皮下移植瘤長至200～300 mm3及HepG2肝癌原位移植瘤模型建立后，經(jīng)尾靜脈注射200 μL MSCsfLuc細胞懸液(5×105個細胞/只) ;注射24 h后，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(濃度2%)，待小鼠麻醉后按150 μg/g腹腔注射熒光素酶底物D-luciferin。10 min后，采用IVIS觀察MSCs-fLuc對腫瘤的趨化作用。

2　結(jié)果

2.1WJ-MSCs的分離及鑒定結(jié)果倒置顯微鏡下可觀察到分離的WJ-MSCs成纖維狀梭形貼壁生長。流式細胞儀測定WJ-MSCs的表面標志CD73、CD90、CD105陽性率均在99%以上。

2.2MSCs-fLuc中fLuc的表達熒光顯微鏡下觀察MSCs-fLuc可見綠色熒光，證明MSCs-fLuc高效表達fLuc。WJ-MSCs感染后第4天，流式細胞儀檢測感染效率達71.3%。IVIS觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)光信號強度與MSCs-fLuc的數(shù)量呈正相關(guān)。

2.3WJ-MSCs對腫瘤的趨化作用在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成功建立BJAB皮下移植瘤模型; IVIS觀察可見腫瘤部位BLI信號(曝光時間為5 min)，證明在小鼠體內(nèi)WJ-MSCs向BJAB腫瘤部位定向遷移。在BALB/c裸鼠中建立人肝癌HepG2細胞的皮下原位移植瘤模型;病理學檢查結(jié)果顯示，原位移植后2周，小鼠肝臟可見腫瘤結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)中央大片壞死，且壞死部分有大量分葉核炎細胞浸潤，其他臟器如肺、脾、腎不見轉(zhuǎn)移; MSCs-fLuc經(jīng)尾靜脈注射入荷瘤小鼠，24 h后IVIS觀察發(fā)現(xiàn)細胞聚集于肝臟腫瘤部位。

3　討論

目前，有關(guān)骨髓、脂肪以及臍帶血來源的MSCs用于腫瘤治療的研究報道較多，而對于人臍帶組織WJ-MSCs介導的腫瘤靶向治療研究較少。WJ-MSCs除具有傳統(tǒng)骨髓來源MSCs的特點外還擁有其自身優(yōu)點，如分離方便、易于基因改造、增殖速度快、免疫源性低等，同時WJ-MSCs的使用不涉及倫理學問題。因此WJ-MSCs越來越受到臨床及基礎研究的重視。MSCs的可塑性及其向損傷部位遷移的能力使其成為組織再生修復中的有利工具［11］。實體瘤浸潤并破壞正常組織形成腫瘤微環(huán)境，同時分泌大量趨化因子及其他蛋白，這一微環(huán)境與損傷組織的微環(huán)境極為相似，因此MSCs會將腫瘤認為是正常損傷或是炎癥部位，從而向腫瘤部位遷移。這一特點可使MSCs作為細胞載體用于基因治療。MSCs可將抗腫瘤藥物(細胞因子、干擾素、凋亡誘導劑等)運輸至腫瘤部位從而抑制腫瘤的生長［12，13］。

IVIS是運用生物發(fā)光或熒光報告基因來追蹤標記細胞在體內(nèi)活動過程的一項成像技術(shù)。本實驗中我們將fLuc標記的WJ-MSCs注射至荷瘤小鼠體內(nèi)，趨化到腫瘤部位的MSCs表達fLuc，在底物熒光素以及氧、ATP的存在下通過酶促反應產(chǎn)生光子，產(chǎn)生的光子可被IVIS檢測到。IVIS方便、靈敏，為體內(nèi)觀察細胞的動向提供了直觀、可靠的數(shù)據(jù)。本研究采用IVIS觀察發(fā)現(xiàn)WJMSCs經(jīng)尾靜脈注射24 h后聚集于腫瘤部位。有研究對MSCs的趨化作用解釋為MSCs跨過內(nèi)皮細胞而被某種組織的脈管系統(tǒng)捕獲的過程［14］，但MSCs趨化作用的具體機制尚未闡明。目前，普遍認為MSCs表面的趨化因子受體在相應趨化因子或細胞因子的誘導下使其發(fā)生定向遷移;其中依賴CXCR4-SDF-1相互作用產(chǎn)生的遷移在腎細胞癌［15］、乳腺癌［16］等惡性腫瘤中也存在。本研究僅觀察了WJ-MSCs對淋巴瘤及肝癌的趨化作用，而且其中涉及的具體機制還有待進一步研究。

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Chemotaxis of mesenchymal stem cells in human umbilical cord tissues on tumor in mice

FANG Jing-chao1，ZHANG Xiao-long，ZHANG Qing，CAO Lei，JIANG Ai-na，LI Qian
(1 Union Stemcell＆Gene Engineering Co.LTD，Tianjin 300384，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the tropism of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (MSCs) for malignant lymphoma of B department and liver carcinoma by using in vivo bioluminescent imaging system (IVIS).Methods The lentivirus expression vector pLenti-fLuc was constructed by restriction enzyme cleavage and linkage.Human umbilical cord Wharton＇s Jelly-derived MSCs (WJ-MSCs) were labeled with firefly luciferase (fLuc) by stable transfection with lentivirus which had been packaged in 293T cells.To demonstrate the tumor tropism of WJ-MSCs，MSC.fLuc were injected intravenously into NOD/SCID mice bearing BJAB lymphoma or BALB/c nude mice which burdened hepatocellular carcinoma in situ with HepG2cells，and the migration in vivo was monitored by IVIS.Results The lentivirus expression vector pLenti-fLuc was successfully constructed，and the expression of fLuc was stable in WJ-MSCs by transfection with lentivirus.The subcutaneous BJAB lymphoma xenograft model was successfully established in NOD/SCID mice，and MSC.fLuc migrated to tumor site after 24 hours by intravenous injection.The HepG2orthotopic hepatocarcima model was successfully established in BALB/c nude mice.When it was injected intravenously，MSC.fLuc＇s tropism for liver was found 48 hours later.Conclusion WJ-MSCs have the capacity of tumor tropism for lymphoma and hepatocarcima，and it provides basis for tumor-targeting therapy which uses MSCs as the vector.

Key words:lymphoma; liver neoplasms; mesenchymal stem cells; bioluminescence imaging; chemotaxis; mice

(收稿日期:2015-02-12)

通信作者簡介:李茜(1961-)，女，副研究員，主要從事細胞生物學研究。E-mail: 1360501260@ qq.com

作者簡介:第一房敬超(1980-)，女，實習研究員，主要從事臍帶間充質(zhì)干細胞腫瘤趨化研究。E-mail: fangjch_80@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(30971291)。

文章編號:1002-266X(2015)21-0001-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R73-3; R394

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.001