蓋他病毒E2蛋白的表達(dá)純化以及抗原性鑒定

陸瑩梅，魏建超，夏 鵬，吳亞玲，黎倩倩，武專昌，齊鵬飛，石 坤，李玉明，邱亞峰，李蓓蓓，劉珂，邵東華，周望平，馬志永

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)沙 410000）

·研究論文·

蓋他病毒E2蛋白的表達(dá)純化以及抗原性鑒定

陸瑩梅1,2,3，魏建超2，夏 鵬2，吳亞玲2，黎倩倩2，武專昌2，齊鵬飛2，石 坤2，李玉明2，邱亞峰2，李蓓蓓2，劉珂2，邵東華2，周望平1,3，馬志永2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)沙 410000）

參考GenBank（EU015066）蓋他病毒（Getah virus，GETV）SH05-6中結(jié)構(gòu)蛋白E2的全基因序列并對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將優(yōu)化后的基因片段克隆至原核表達(dá)載體 pColdⅠ中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCold-E2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21 ( DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)后，SDS- PAGE和Western blot進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量46 kDa處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期相符，且占大腸桿菌表達(dá)蛋白總量的80%。結(jié)果證明E2基因在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，并且能與抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)。本研究為GETV快速檢測(cè)方法的建立和GETV流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

蓋他病毒；原核表達(dá)；E2基因

蓋他病毒（Getah virus，GETV）是一種蟲媒病毒，屬于披膜病毒科（Togaviridae）、甲病毒屬（Alphavirus）成員，目前為止已分離到的病毒株型約為30余種[1]。MM2021是分離到的第1株蓋他病毒，于1955年在馬來(lái)西亞吉隆的雪被庫(kù)蚊體內(nèi)分離得到[2]。GETV廣泛分布于世界各地，主要是在沿太平洋的亞洲國(guó)家和澳大利亞北部地區(qū)流行[3,4]。血清學(xué)調(diào)查顯示GETV抗體普遍存于脊椎動(dòng)物的血液中，但GETV并不在自然宿主中引起急性傳染病，只有通過蚊蟲叮咬才能傳播疾病[5-7]。GETV的致病機(jī)理十分復(fù)雜，它在豬群中能引起母豬繁殖性障礙和初生仔豬的死亡，并且從健康豬、死胎和病死仔豬的體內(nèi)都能分離到該病毒[8]。GETV在乳鼠體內(nèi)能引起急性腦炎綜合征（acute encephalitis syndrome，AES），出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、氣喘、腹式呼吸和關(guān)節(jié)炎等癥狀。近年來(lái)，我國(guó)廣東省、云南省、河北省、甘肅省和海南省等均有GETV引發(fā)疾病的報(bào)道[9-11]，說明GETV在我國(guó)已逐步流行，所以對(duì)豬場(chǎng)實(shí)施定期檢疫和GETV的快速診斷就顯得十分重要[12]。

GETV屬于塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus，SFV）復(fù)合型囊膜病毒[3]，其遺傳物質(zhì)為單鏈線形正股RNA，3′末端擁有polyA尾，這是其具有感染性的原因之一，5′端為O型的帽子結(jié)構(gòu)[9,13,14]。GETV由4種非結(jié)構(gòu)蛋白（nsP1～nsP4）和結(jié)構(gòu)蛋白（E1、E2、E3、6K、Cap蛋白）構(gòu)成。其中由E基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白是GETV最關(guān)鍵的蛋白，它不僅構(gòu)成了病毒粒子的表面突起，而且在吸附靶細(xì)胞和致病及誘發(fā)機(jī)體的抗感染免疫中發(fā)揮著重要的作用[15]。本研究根據(jù)GenBank（EU015066）蓋他病毒株（SH05-6）合成E2全基因序列，經(jīng)過酶切驗(yàn)證和測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pColdⅠ-E2，并在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中獲得了高效表達(dá)。將E2蛋白進(jìn)行純化和透析后，制備抗E2蛋白多克隆抗體，Western blot鑒定結(jié)果表明該抗體能夠與E2蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒E.coli BL21（DE3）菌株及表達(dá)載體pColdⅠ由本實(shí)驗(yàn)室保存；pUC57-E2由金唯智有限公司合成并提供。

1.2 試劑質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；蛋白預(yù)染Marker和ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司；鎳離子親和柱購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ購(gòu)自大連寶生物有限公司；鼠源His單抗購(gòu)自艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG和佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.3 E2基因的合成參考GenBank（EU015066）GETV（SH05-6）的結(jié)構(gòu)蛋白E2的全基因序列，長(zhǎng)度為1278 bp。將序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，分別在上、下游插入兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和XbaⅠ（小寫字母為酶切位點(diǎn)）。序列由金唯智有限公司合成。將序列克隆至載體pUC57上，構(gòu)建了重組載體pUC57-E2。

1.4 重組質(zhì)粒pColdⅠ-E2的構(gòu)建將pUC57-E2和pColdⅠ載體轉(zhuǎn)化至E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，37℃振蕩過夜，提取質(zhì)粒，使用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶分別對(duì)載體進(jìn)行酶切，得到酶切產(chǎn)物E2和pColdⅠ。將E2和pColdⅠ用T4 DNA連接酶于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于Amp+的LB培養(yǎng)皿中，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。d2隨機(jī)挑選單克隆菌落，37℃振蕩培養(yǎng)至菌體渾濁，經(jīng)酶切驗(yàn)證的陽(yáng)性菌液送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與合成片段序列一致，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并命名為重組質(zhì)粒pColdⅠ-E2。

1.5 重組質(zhì)粒pColdⅠ-E2的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒pColdⅠ-E2轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coli BL21（DE 3）中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，18℃振蕩過夜。收集菌體加入PBS進(jìn)行超聲裂解，高速離心后分別收集上清和沉淀，加入5×SDS buffer煮沸10 min后進(jìn)行SDSPAGE電泳，對(duì)SDS-PAGE蛋白膠染色，觀察蛋白表達(dá)情況，同時(shí)設(shè)置空載體和未誘導(dǎo)表達(dá)組作為對(duì)照。

1.6 重組蛋白E2的純化和透析挑取陽(yáng)性單菌落，接種到4 mL含100μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min的搖床培養(yǎng)過夜。d2取出菌液，按1∶100接種于100 mL含100μg/mL Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃、200 r/min培養(yǎng)，至OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)停止，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，低溫誘導(dǎo)過夜，d2離心收集菌體。表達(dá)后的菌體進(jìn)行超聲破碎，差速離心后收集包涵體蛋白。采用自動(dòng)液相層析系統(tǒng)對(duì)蛋白進(jìn)行純化，純化后的蛋白進(jìn)行透析處理，以去除蛋白溶液中的有害物質(zhì)，目的蛋白于-80℃保存。

1.7 重組蛋白E2的Western blot鑒定將E2蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，低溫、恒流240mA 2 h的條件下將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取出膜浸沒在脫脂乳中封閉1 h。封閉過后分別使用1∶5000稀釋的鼠源His單抗和1∶2000稀釋的本實(shí)驗(yàn)制備的多克隆抗體作為一抗，4℃搖床孵育過夜。d2取出膜經(jīng)TBST充分洗滌3次，每次10 min，再加入1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫孵育1.5 h；TBST反復(fù)洗滌5次，每次10 min，最后用ECL發(fā)光試劑盒對(duì)膜進(jìn)行顯色。

1.8 多克隆抗體的制備對(duì)兔子進(jìn)行免疫以獲得抗E2蛋白多克隆抗體血清。將重組蛋白pColdⅠ-E2與弗氏佐劑按1∶1進(jìn)行乳化，乳化完全后按0.5 mg/只經(jīng)皮下多點(diǎn)注射兔子，每隔2周加強(qiáng)1次免疫，免疫劑量為每只0.6 mg/只，待效價(jià)達(dá)到1∶50 000時(shí)停止免疫。共免疫5次。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pColdⅠ-E2的構(gòu)建將E2全基因組序列連接到pUC57載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pUC57-E2，受體菌株為E.coli DH5α。重組質(zhì)粒pUC57-E2經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后在1278 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期相符（圖1）。將膠回收產(chǎn)物E2基因片段與載體pColdⅠ進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證。電泳結(jié)果顯示，在1278 bp和4407 bp出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期相符（圖2）。挑選酶切驗(yàn)證陽(yáng)性菌液送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與合成片段序列一致，表明重組載體 pColdⅠ-E2構(gòu)建成功。

圖1 pUC57-E2酶切產(chǎn)物鑒定結(jié)果Fig.1 Identifi cation of pUC57-E2 by restriction enzymes digestion

1: 重組質(zhì)粒pColdⅠ-E2單酶切; 2: 重組質(zhì)粒pColdⅠ-E2雙酶切; 3: pColdⅠ; 4: E2片段陽(yáng)性對(duì)照; M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL15 000)1: Recombinant plasmid pColdⅠ-E2 digested with EcoRⅠ; 2: Recombinant plasmid pColdⅠ-E2 digested with EcoRⅠand XbaⅠ; 3: pColdⅠ; 4: Positive control of gene segment E2; M: DNA Marker(DL15 000)

2.2 重組質(zhì)粒pColdⅠ-E2的誘導(dǎo)表達(dá)菌體經(jīng)過超聲破碎，高速離心后收集上清和沉淀，沉淀經(jīng)差速離心后得到包涵體蛋白，同時(shí)設(shè)置空載體pColdⅠ和未誘導(dǎo)pColdⅠ-E2作為對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE（圖3）。結(jié)果顯示在包涵體泳道上出現(xiàn)了相對(duì)分子質(zhì)量約為46 kDa的目的條帶，而在上清、空載體pColdⅠ和未誘導(dǎo)pColdⅠ-E2泳道中均未出現(xiàn)目的條帶。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pColdⅠ-E2在E.coli BL21 ( DE 3 )中以包涵體形式得到成功表達(dá)。

圖3 pColdⅠ-E2的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定Fig.3 SDS-PAGE analysis of IPTG induced expression of pColdⅠ-E2

2.3 重組蛋白E2的純化大量表達(dá)的目的蛋白E2經(jīng)鎳柱純化，結(jié)果顯示純化后的蛋白條帶單一且濃度高（圖4），收集純化后的目的蛋白進(jìn)行透析，與佐劑混合乳化可作為免疫抗原使用。

2.4 重組蛋白E2的Western blot鑒定將已誘導(dǎo)的pColdⅠ-E2和空載體pColdⅠ經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用商品化的鼠源His單抗1∶5000稀釋作為一抗，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG1∶10 000稀釋作為二抗進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pColdⅠ-E2在46 kDa處出現(xiàn)目條帶，且條帶單一，陰性對(duì)照pColdⅠ未出現(xiàn)目的條帶（圖5）。取5次免疫后的血清1∶2000稀釋作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG1∶10 000稀釋作為二抗，進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，E2蛋白多克隆抗體能與pColdⅠ-E2發(fā)生特異性結(jié)合在46 kDa處出現(xiàn)目的條帶，而與空載體pColdⅠ并沒有特異性結(jié)合出現(xiàn)條帶（圖6）。結(jié)果證明，重組蛋白E2具有良好的免疫原性且能與多克隆抗體血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖4 重組蛋白E2純化結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE result of the purifi ed pColdⅠ-E2 protein

圖5 重組蛋白E2的Western blot鑒定Fig.5 Identifi cation of pColdⅠ-E2 protein using anti-His Tag mouse McAb by Western blot

3 討論

GETV屬于蟲媒病毒，刺擾伊蚊（Aedes vexans）被認(rèn)為是最主要的傳播媒介，其次是三帶喙庫(kù)蚊（Culex tritaeniorhy）[16]。GETV主要分布于我國(guó)南方城市，以云南省和海南省為主，流行時(shí)間為每年的7～9月，屬于蚊蟲高發(fā)時(shí)期。GETV可引起人類和脊椎動(dòng)物感染，屬于人畜共患病[17]，馬和豬是其主要宿主。1966年和1969年，澳大利亞學(xué)者對(duì)人和動(dòng)物的血清抗體進(jìn)行檢查，證明了蓋他病毒對(duì)人和動(dòng)物都存在感染性[18]，直到現(xiàn)在仍然沒特效的治療方法。用GETV滅活疫苗免疫賽馬，被證明獲得了較好的保護(hù)效果，說明GETV疫苗可以預(yù)防病毒對(duì)動(dòng)物的感染[19]。

圖6 E2蛋白多克隆抗體的Western blot鑒定Fig.6 Identifi cation of E2 protein using rabbit polyclonal antibody by Western blot

我國(guó)已報(bào)道的GETV檢測(cè)方法主要是通過采集蚊蟲對(duì)病毒進(jìn)行分離[12]，但是這種方法卻存在許多弊端。首先蚊蟲采集受到地域和季節(jié)的限制，其次病毒分離需要先感染細(xì)胞或動(dòng)物，然后再提取病原進(jìn)行檢測(cè)分離，傳代周期較長(zhǎng)，無(wú)法快速得到結(jié)果。所以建立更準(zhǔn)確、快速、便捷的實(shí)驗(yàn)室診斷方法顯得尤為重要[15]。本研究采用直接合成E2基因全序列，避免了病原分離耗時(shí)過長(zhǎng)，又減少了細(xì)胞培養(yǎng)易被污染和病毒丟失的可能性。同時(shí)，大腸桿菌在低溫誘導(dǎo)時(shí)能自身產(chǎn)生CapA啟動(dòng)子，它能促進(jìn)RNA聚合酶更好識(shí)別載體pColdⅠ啟動(dòng)蛋白快速表達(dá)，而大腸桿菌自身的蛋白表達(dá)則會(huì)在低溫中受到抑制[20]。表達(dá)載體pColdⅠ自身所帶有的6×His是重組蛋白的識(shí)別標(biāo)簽[21]，它能與目的蛋白融合表達(dá)，再通過鎳柱和自動(dòng)液相層析儀對(duì)蛋白進(jìn)行純化，可獲得純度較高的蛋白。純化后的蛋白放入透析袋中進(jìn)行透析以去除尿素、咪唑等有害物質(zhì)，這樣能避免切膠免疫對(duì)動(dòng)物的毒性。利用純化蛋白制備的多克隆抗體能夠很好的與E2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。本研究結(jié)果為GETV相關(guān)檢測(cè)方法的建立和病原學(xué)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT E2 PROTEIN OF GETAH VIRUS

LU Ying-mei1,2,3, WEI Jian-chao2, XIA Peng2, WU Ya-ling2, LI Qian-qian2, WU Zhuan-chang2, QI Peng-fei2, SHI Kun2, LI Yu-ming2, QIU Ya-feng2, LI Bei-bei2, LIU Ke2, SHAO Dong-hua2, ZHOU Wang-Ping1,3, MA Zhi-yong2

(1.College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China, 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3.Hunan Institute of Animal and Veterinary Science, Changsha 410000, China)

The E2 gene of Getah virus strain SH05-6 was optimized and synthesized according to the complete genome sequence published in GenBank (EU015066).The synthesized E2 gene was cloned into the expression vector pCold I for generation of a recombinant plasmid pColdⅠ-E2.The plasmid pColdⅠ-E2 was then transformed into E.coli BL21 (DE3) competent cells following induction with IPTG.The expression of the target E2 protein was detected in SDS–PAGE and Western blot.The results showed that the recombinant E2 was a 46 kDa protein corresponding to the molecular mass of the expected E2 and accounted for approximately 80% of total protein expressed in E.coli.The recombinant E2 protein reacted with antiserum against Getah virus.The availability of the recombinant E2 protein has laid a foundation for development of rapid detection and epidemiological investigation methods for Getah virus.

Getah virus; prokaryotic expression; E2 gene

S852.659.6

A

1674-6422（2015）02-0015-06

2015-01-12

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2013）第5-6號(hào)）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303045）；國(guó)家自然科學(xué)青年基金（31302116）

陸瑩梅，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

馬志永， E-mail∶ zhiyongma@shvri.ac.cn；周望平， E-mail∶ wpklagh@126.com