基因組重組選育強(qiáng)降解蘋果酸毛葡萄酒酵母及其發(fā)酵特性*

李瑋，朱月蓮，易菊陽，黃梅華，張勁，陳國品，曹慕明，張瑛

1(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧，530007)

2(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧，530007)

3(廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧，530004)

毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)作為廣西獨(dú)具特色品種之一，與普通釀酒葡萄相比，其果實(shí)中白藜蘆醇、花色苷等功能性成分含量更高，適合釀造保健性能優(yōu)異的特色葡萄酒［1-2］。但由于毛葡萄果實(shí)中蘋果酸含量相當(dāng)高，導(dǎo)致葡萄原酒酸澀粗糙，口味不佳，因此毛葡萄原酒通常需要經(jīng)過物理、化學(xué)或生物手段進(jìn)行降酸處理方可作為成品出售［3］。采用物理或化學(xué)手段降酸容易影響酒的風(fēng)味和穩(wěn)定性，因而目前國際上通常利用乳酸菌對(duì)葡萄酒原酒進(jìn)行二次蘋果酸-乳酸發(fā)酵去除蘋果酸，該工藝對(duì)于發(fā)酵過程的控制要求很高，還會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，同時(shí)加大釀造失敗的風(fēng)險(xiǎn)［4-5］。通過生物技術(shù)手段選育具有降酸性能的葡萄酒酵母菌株，是葡萄酒生物法降解蘋果酸工藝中的另一條技術(shù)路線。國內(nèi)研究人員在降酸釀酒酵母的選育方面進(jìn)行了一定的研究，如2000年高年發(fā)等曾對(duì)釀酒酵母和粟酒裂殖酵母進(jìn)行融合育種，融合菌株發(fā)酵過程中酒體蘋果酸含量從11.5 g/L降低至7.5 g/L［6］;2005年史東健等進(jìn)行了類似研究，所得融合菌株可將酒體中蘋果酸含量由11 g/L降低至4.3 g/L［7］。目前報(bào)道的融合酵母菌株育種均采用的是雙親本傳統(tǒng)原生質(zhì)體融合法，尚未有采用多親本多輪次融合的基因組重組法的研究報(bào)道。

基因組重組技術(shù)(genome shuffling)，是一種基于融合子高通量篩選手段，通過對(duì)多個(gè)親本微生物菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行多輪次融合，以實(shí)現(xiàn)各親本菌株的基因組在融合子內(nèi)重組，從而提高融合子某些人們需要的特性的育種手段［8-9］。該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于提高醇類、有機(jī)酸、抗生素等微生物代謝產(chǎn)物及酶類的產(chǎn)量［10-14］。

本論文針對(duì)毛葡萄酒生產(chǎn)過程中高蘋果酸含量問題，選取3株降解蘋果酸能力強(qiáng)的解蘋果酸裂殖酵母和3株產(chǎn)酒精能力優(yōu)良的釀酒酵母作為出發(fā)菌株，通過基因組重組技術(shù)，構(gòu)建具有較強(qiáng)蘋果酸降解能力的葡萄酒酵母融合菌株，用于毛葡萄酒的釀造，以探索將發(fā)酵產(chǎn)酒和生物降酸在同一發(fā)酵過程中完成的可行性，為縮短毛葡萄酒生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本和生產(chǎn)過程中的風(fēng)險(xiǎn)，提高毛葡萄酒品質(zhì)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

降解蘋果酸酵母菌株:解蘋果酸裂殖酵母D2、D3、D6;產(chǎn)酒酵母菌:釀酒酵母 A1、A2、A3;上述菌株分離自野生毛葡萄產(chǎn)地，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基［15］

(1)YPD培養(yǎng)基:葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%，自然pH值，添加1.5%瓊脂為固體培養(yǎng)基，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

(2)原生質(zhì)體再生完全培養(yǎng)基 (HYPD):在YPD固體培養(yǎng)基中添加蔗糖至17%，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

(3)蘋果酸降解指示培養(yǎng)基:YNB 2 mL，YPD 3 mL，(NH4)2SO40.5%，蘋果酸0.3%，葡萄糖2%，瓊脂1.2%，溴酚蘭指示劑1 mL，蒸餾水定容至100 mL，pH值3.8，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。其中，溴酚蘭指示劑:0.1 g溴酚蘭，加入0.2 mol/L NaOH 7.45 mL，再用蒸餾水稀釋至250 mL。

1.1.3 試劑［6］

(1)磷酸緩沖液-蔗糖高滲溶液(PBS):pH6.8磷酸緩沖液添加蔗糖至17%。

(2)促融劑:聚乙二醇(6000)40 g于100 mL PBS溶液中，添加CaCl2至0.4 mol/L。

(3)EDTA-β-巰基乙醇溶液:0.05 mol/L EDTA和0.2%(v/v)β-巰基乙醇。

(4)蝸牛酶:蝸牛酶溶于PBS中至濃度2.0%(w/v)，0.45 μm 濾膜過濾除菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 親本庫構(gòu)建

將活化的親本釀酒酵母出發(fā)菌A1、A2、A3分別轉(zhuǎn)接于產(chǎn)孢培養(yǎng)基上產(chǎn)孢培養(yǎng)后，離心收集菌體，洗滌懸浮后加2%蝸牛酶，37℃酶解3 h后，經(jīng)稀釋、懸浮，將孢子懸液涂布于YPD平板上，28℃培養(yǎng)3～5 d，平板上再生出單菌落即為釀酒酵母單倍體細(xì)胞［15］。因解蘋果酸裂殖酵母自身即為單倍體營養(yǎng)細(xì)胞，故不需分離其單倍體。上述獲取的單倍體細(xì)胞用于構(gòu)建親本庫。

1.2.2 基因組重組

1.2.2.1 原生質(zhì)體制備與再生［15］

將上述2種單倍體細(xì)胞親株分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中28℃、160 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各取10 mL離心收集菌體，磷酸緩沖液洗滌2次，經(jīng)EDTA-β-巰基乙醇溶液靜置處理10 min，用高滲緩沖液洗滌3次后收集菌體，加入蝸牛酶液10 mL，30℃水浴處理0.5～1 h，當(dāng)90%以上細(xì)胞為原生質(zhì)體時(shí)，離心收集菌體用高滲緩沖液洗滌2次后，再次離心收集原生質(zhì)體。

1.2.2.1 原生質(zhì)體滅活與融合子檢出［7］

取解蘋果酸裂殖酵母原生質(zhì)體懸液5 mL，分別在 50、60、70 ℃水浴中處理 2、4、6、8、10、12 min;釀酒酵母原生質(zhì)體懸液5 mL，分別在紫外(30 W，垂直距離 20 cm)照射下處理 1、2、3、4、5、6 min;經(jīng)再生培養(yǎng)檢測(cè)滅活效果。

上述滅活原生質(zhì)體懸液等量混合，離心去上清，加入10 mL促融劑，30℃保溫30 min。將融合子懸液經(jīng)高滲緩沖液洗滌后適當(dāng)稀釋，取0.1 mL懸液與45℃左右的原生質(zhì)體再生完全培養(yǎng)基(HYPD)5 mL混合均勻，倒入下層HYPD培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3～5 d。平板上長(zhǎng)出的單菌落即為融合子。

1.2.2.3 遞歸融合

將篩選出的融合子與原始親本混合，重復(fù)上述步驟進(jìn)行原生質(zhì)體制備、滅活、融合、再生。

1.2.3 表型篩選

將上述經(jīng)過2輪基因組重組檢出的融合子接種于蘋果酸降解指示培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3 d，呈藍(lán)色菌落的融合子即為目的菌株［6］。

1.2.4 融合菌株遺傳穩(wěn)定性和發(fā)酵性能檢測(cè)［14］

對(duì)獲得的重組菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)5代，分別接種于含50%葡萄汁的液體YPD培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以5%接種量接入毛葡萄汁中，28℃靜置發(fā)酵，每24 h取樣測(cè)定產(chǎn)酒精及降酸性能。

1.2.5 分析方法

有機(jī)酸和酒精度測(cè)定方法參照GB/T 15038-2006進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體制備與再生

在從野生毛葡萄產(chǎn)地篩選獲得優(yōu)良產(chǎn)酒酵母菌和降解蘋果酸酵母菌株并構(gòu)建單倍體細(xì)胞親本庫的基礎(chǔ)上，首先以釀酒酵母A1和解蘋果酸裂解酵母D2為研究對(duì)象，對(duì)其原生質(zhì)體制備和再生條件進(jìn)行了深入研究。結(jié)果表明，這2類菌株原生質(zhì)體形成和再生條件具有很好的一致性，以磷酸緩沖液-蔗糖高滲溶液作為穩(wěn)滲系統(tǒng)，28℃、160 r/min搖床培養(yǎng)菌體20 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在pH6.8、蝸牛酶濃度2.0%(w/v)，30℃水浴處理1 h后，釀酒酵母A1和解蘋果酸裂解酵母D2原生質(zhì)體的形成率分別達(dá)到96.2%和92.8%。28℃條件下，采用原生質(zhì)體再生完全培養(yǎng)基進(jìn)行再生培養(yǎng)，釀酒酵母A1和解蘋果酸裂解酵母D2原生質(zhì)體的再生率分別達(dá)到19.8%和17.2%。

2.2 原生質(zhì)體滅活

雙親滅活是一種十分可靠的用于融合子檢出的標(biāo)記手段，具有使用方便的突出優(yōu)點(diǎn)，因此在基因組重組中被廣泛應(yīng)用。通常采用紫外線照射、加熱和化學(xué)試劑處理等對(duì)雙親原生質(zhì)體分別滅活，損傷互補(bǔ)的融合子可在再生平板上長(zhǎng)出菌落。本實(shí)驗(yàn)分別采用紫外線照射處理釀酒酵母原生質(zhì)體和加熱處理解蘋果酸裂殖酵母原生質(zhì)體。

紫外線滅活實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表1)，當(dāng)釀酒酵母A1原生質(zhì)體在30 W、垂直距離20 cm紫外照射條件下處理5 min后，原生質(zhì)體致死率達(dá)到100%。因此，選用紫外照射5 min作為釀酒酵母原生質(zhì)體紫外滅活時(shí)間。

表1 紫外線滅活時(shí)間對(duì)釀酒酵母A1原生質(zhì)體致死率的影響Table 1 Effects of UV inactivation time on the lethallty rate of Saccharomyces cerevisiae A1 protoplasts

熱滅活實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表2)，當(dāng)解蘋果酸裂殖酵母D2原生質(zhì)體在60℃恒溫水浴中處理10 min后，原生質(zhì)體致死率達(dá)到100%。這與大多數(shù)酵母菌加熱到60℃時(shí)即可被殺死是一致的;而當(dāng)溫度超過65℃時(shí)，原生質(zhì)體容易粘結(jié)成團(tuán)，不利于原生質(zhì)體的融合［16］。因此，本試驗(yàn)確定 60℃、10 min作為解蘋果酸裂殖酵母原生質(zhì)體熱滅活條件。

2.3 基因組重組

2.3.1 第1輪重組

將解蘋果酸裂殖酵母 D2、D3、D6和釀酒酵母A1、A2、A3通過原生質(zhì)體制備和滅活后，等量混合，加入促融劑介導(dǎo)基因組重組，通過原生質(zhì)體再生完全培養(yǎng)基雙層培養(yǎng)共檢測(cè)出56株融合子。經(jīng)蘋果酸降解指示培養(yǎng)基初篩和毛葡萄汁發(fā)酵復(fù)篩，共獲得6株性狀優(yōu)良的重組菌株，結(jié)果見表3。

表2 熱滅活溫度和時(shí)間對(duì)解蘋果酸裂殖酵母D2原生質(zhì)體致死率的影響Table 2 Effects of hear inactivation temperature and time on the lethallty rate of Schizosaccharomyces malidevorans D2 protoplasts

表3 第1輪基因組重組篩選結(jié)果Table 3 Results of the first-round genome shuffling

2.3.2 第2輪重組

將第1輪基因組重組獲得的6株優(yōu)良重組菌株與解蘋果酸裂殖酵母D2、D3、D6和釀酒酵母A1、A2、A3一起作為親本出發(fā)菌株，進(jìn)行原生質(zhì)體制備、滅活、融合、再生、篩選，共獲得5株性狀優(yōu)良的重組菌株，同時(shí)對(duì)這5株重組菌進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of genetic stability of strain J7，J8，J9，J10，J11

重組菌株F8、F9、F11都具有良好的遺傳穩(wěn)定性，其中F8菌株5次傳代實(shí)驗(yàn)，毛葡萄汁發(fā)酵液中平均總酸量為 4.89 g/L，平均乙醇體積分?jǐn)?shù)為10.39% 。菌株F7和F10遺傳穩(wěn)定性不好，5次傳代后總酸量和酒精度均出現(xiàn)了不同程度的升高和降解。

2.4 融合菌株與親本菌株性能對(duì)比

經(jīng)過2輪基因組重組選育，融合菌株J8具有優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性和發(fā)酵性能，將融合菌株F8與釀酒酵母A1、解蘋果酸裂解酵母D2進(jìn)行發(fā)酵性能對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其產(chǎn)酒精能力接近于親本釀酒酵母，降酸能力接近于親本解蘋果酸裂殖酵母(表5)。

表5 F8菌株與親本菌株發(fā)酵性能對(duì)比Table 5 Comparison of fermentation performance between F8 and parental strain

3 結(jié)論

目前，國內(nèi)研究人員在降酸釀酒酵母的選育方面進(jìn)行了一定的研究，2000年高年發(fā)等曾對(duì)釀酒酵母和粟酒裂殖酵母進(jìn)行融合育種，融合菌株發(fā)酵過程中酒體蘋果酸含量從11.5 g/L降低至7.5 g/L［6］;2005年史東健等進(jìn)行了類似研究，所得融合菌株可將酒體中蘋果酸含量由11 g/L降低至4.3 g/L，發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%［7］;2009年袁耀武等報(bào)道所獲得的酵母融合菌株發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)為8.3% ，總酸量為7.7 g/L［17］。上述報(bào)道的融合酵母菌株均采用的是雙親本傳統(tǒng)原生質(zhì)體融合法，而本研究利用基因組重組技術(shù)，選育獲得了1株遺傳穩(wěn)定的融合菌株F8，其毛葡萄汁發(fā)酵液中平均總酸量為4.89 g/L，平均乙醇體積分?jǐn)?shù)為10.39% ，發(fā)酵性狀優(yōu)于上述降酸酵母融合菌株。不足的是，該融合菌株目前僅對(duì)野生毛葡萄酒發(fā)酵表現(xiàn)出優(yōu)良特性，對(duì)于其他品種葡萄酒發(fā)酵是否可行還需進(jìn)一步探究。另外，本論文也成功證明了基因組重組技術(shù)在葡萄酒酵母選育中的有效性和高效性，同時(shí)也為毛葡萄酒釀造中一步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酒和降酸的新工藝奠定了基礎(chǔ)。

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