生姜蛋白酶的凝乳作用及相關(guān)機(jī)理探討*

范金波，侯宇，黃訓(xùn)文，周素珍，呂長鑫，馮敘橋

1(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州，121013)

2(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

不同來源凝乳酶的差異在于它們對酪蛋白持續(xù)水解的速率上，只有在牛乳自然pH下具有較高凝乳活力/蛋白水解活力比值的蛋白酶才適合作為凝乳酶［1］。如若蛋白水解活力過高，則在凝乳后會對酪蛋白進(jìn)行過度水解，產(chǎn)生大量的小肽，甚至破壞初期形成的酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)。小牛皺胃酶在凝乳過程中只水解κ-酪蛋白的Phe105-Met106肽鍵，即使?jié)舛忍岣?0倍也是如此，其對κ-酪蛋白的水解作用是限制性水解［2］。

酪蛋白水解是凝乳過程中的一個(gè)重要生化反應(yīng)，但對生姜蛋白酶水解酪蛋白引起凝乳的機(jī)理尚不明確。本研究主要利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和液相色譜技術(shù)分析生姜蛋白酶對酪蛋白的水解作用，通過質(zhì)譜法分析了生姜蛋白酶對κ-酪蛋白的酶切位點(diǎn)，闡明生姜蛋白酶在凝乳酶解階段的相關(guān)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低熱脫脂乳粉，新西蘭西部乳業(yè)有限公司提供;二硫蘇糖醇，美國Amresco公司;尿素，美國Amresco公司;檸檬酸鈉，天津福晨試劑有限公司;三氟乙酸，色譜級，美國Thermo Fisher Scientific公司;Tris堿，美國Amresco公司;乙腈，色譜級，美國 Thermo Fisher Scientific公司。

電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(Q-TOF2)，美國Waters公司;基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)，Reflex III，德國 Bruker Daltonics公司;高效液相色譜儀，LC10A vp，日本Shimadzu公司;凝膠成像儀，UVP GDS-8000，上海天能公司;凝膠電泳儀，Protein II，美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溫度對生姜蛋白酶水解酪蛋白的影響

用pH 6.5，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制5 mg/mL α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白溶液，按體積比 1∶20分別加入實(shí)驗(yàn)室前期純化的生姜蛋白酶A和B液，在30～80℃反應(yīng)15 min，加入樣品緩沖液終止反應(yīng)，渦旋混勻后在沸水浴中處理5～10 min，冷卻至室溫，5 000 r/min離心1 min，用于電泳分析。

1.2.2 反應(yīng)時(shí)間對生姜蛋白酶水解酪蛋白的影響

用pH 6.5，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制5 mg/mL α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白溶液，按體積比 1∶20分別加入純化的生姜蛋白酶A和B液，在60℃反應(yīng) 5、15、30、60、120、180 min，加入樣品緩沖液終止反應(yīng)，渦旋混勻后在沸水浴中處理5～10 min，冷卻至室溫，5 000 r/min離心1 min，用于電泳分析。

1.2.3 Urea SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳

利用Urea SDS-PAGE分析生姜蛋白酶水解酪蛋白的產(chǎn)物，方法參照Andrews等并做了部分修改［3］，采用15%分離膠和4%濃縮膠。濃縮膠和分離膠以及樣品緩沖液加入6 mol/L尿素和0.4%SDS。

1.2.4 生姜蛋白酶對脫脂乳中酪蛋白的水解作用

(1)分析生姜蛋白酶對脫脂乳中酪蛋白的水解作用。用去離子水配制12%的復(fù)原脫脂乳。將脫脂乳在60℃預(yù)熱15 min，按體積比1∶20加入生姜蛋白酶(1 395 SU/mL)，在恒溫水浴中孵育5、30和60 min后，立即加入3倍體積樣品緩沖液(8 mol/L尿素，165 mmol/L Bis-Tris(2.0%)，44 mmol/L(1.3%)檸檬酸鈉和20 mmol/L二硫蘇糖醇)終止反應(yīng)(蛋白濃度約為10 mg/mL)，迅速混合均勻，室溫下靜置1 h后，用0.45 μm濾膜過濾，用作C4反相液相色譜分析。

(2)分析生姜蛋白酶水解脫脂乳中κ-酪蛋白的主要水解產(chǎn)物。將脫脂乳在60℃預(yù)熱15 min，100 mL脫脂乳中加入生姜蛋白酶0.43 mL(600 SU)后恒溫孵育60 min，迅速冷卻至室溫，用手持式均質(zhì)機(jī)勻漿2 min，用醋酸調(diào)整pH至4.6，在3 000 r/min下離心30 min，沉淀部分用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。同時(shí)將脫脂乳的pH調(diào)至4.6，離心后將沉淀凍干，所得酪蛋白作為對照。將pH 4.6沉淀部分用樣品緩沖液配成濃度約16.7 mg/mL的溶液，溶液用0.45 μm的濾膜過濾，用連接C8反相色譜柱的RPHPLC色譜分析。色譜分析過程中，手動收集κ-酪蛋白水解產(chǎn)物的峰尖組分(圖6中類κ-副酪蛋白組分的色譜峰)，用于MALDI-TOF/MS質(zhì)譜分析。

(3)色譜條件。參照Bonizzi等和Hayaloglu等的方法［4-5］，有部分修改。色譜柱:Phenomenex Jupiter C4(250 mm ×4.6mm，孔徑 300 ?，5 μm 粒徑);Agela Venusil ASB C8(250 mm×4.6 mm，孔徑150 ?，5 μm 粒徑)。柱溫:25 ℃，進(jìn)樣量:20 μL，流速:1.0 mL/min，檢測波長:214 nm，流動相:溶劑 A:0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液;溶劑B:0.1%三氟乙酸(TFA)乙腈溶液。梯度混合程序如表1所示。

表1 RP-HPLC分析的流動相梯度表Table 1 Gradient conditions of the mobile phase for RP-HPLC analysis

1.2.5 質(zhì)譜分析

用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制5 mg/mL κ-酪蛋白溶液，按體積比1∶20加入生姜蛋白酶溶液，在60℃下水解1 h，然后取1份在95℃加熱10 min將生姜蛋白酶滅活。水解液用3 000 Da超濾離心管在7 500 r/min離心30 min脫鹽，用于MALDI-TOF/MS分析，基質(zhì)為芥子酸，加速電壓為20 kV，檢測模式為正離子線性模式，分子質(zhì)量范圍為3 000～20 000 Da。另1份水解液加入等體積凝膠電泳樣品緩沖液用Urea SDS-PAGE凝膠電泳分離，切下目標(biāo)染色條帶用胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解，酶解液冷凍干燥后用于Q-TOF2串聯(lián)質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜蛋白酶對酪蛋白的水解作用

圖1為生姜蛋白酶在不同溫度下水解αS1-、β-和κ-酪蛋白的電泳圖。

圖1 生姜蛋白酶水解α-CN(a)、β-CN(b)和κ-CN(c)的urea SDS-PAGE電泳圖Fig.1 Urea-SDS/PAGE patterns of isolated bovine α-CN(a)，β-CN(b)，and κ-CN(c)by ginger proteases

結(jié)果表明，生姜蛋白酶對αS1-、β-和κ-酪蛋白單體都具有水解能力，對αS1-酪蛋白的水解能力最強(qiáng)，70℃下仍能將αS1-酪蛋白幾乎全部降解。對β-和κ-酪蛋白的水解能力比對αS1-酪蛋白小，只有部分被水解，溫度高于60℃時(shí)，對β-和κ-酪蛋白的水解能力下降。

生姜蛋白酶水解α-酪蛋白主要生成3個(gè)肽段:α-CN 1、α-CN 2和α-CN 3。溫度從30℃升高至70℃，α-CN 1逐漸減少，生成分子量更小的肽段，α-CN 2和α-CN 3的濃度沒有明顯的變化(圖1a)。生姜蛋白酶水解α-酪蛋白生成分子量較小的產(chǎn)物，如圖1b所示，說明生姜蛋白酶對β-酪蛋白的水解程度較為徹底。生姜蛋白酶水解κ-酪蛋白生成的主要產(chǎn)物是 κ-CN 2和 κ-CN 3和 κ-CN 1(圖1c)。

圖2是生姜蛋白酶在60℃下水解酪蛋白組分隨時(shí)間變化的電泳圖。結(jié)果表明αs1-酪蛋白的水解程度最大，經(jīng)過1 h幾乎全部降解(圖2a)。β-酪蛋白的水解度最小，經(jīng)過3 h只有小部分被水解(圖2b)。κ-酪蛋白在30 min內(nèi)大部分被降解，但隨后水解的程度很小，生成的主要產(chǎn)物(κ-CN 2、κ-CN 3和κ-CN 1)比較穩(wěn)定，沒有被進(jìn)一步降解。表明生姜蛋白酶對κ-酪蛋白的水解是選擇性的水解。

2.2 生姜蛋白水解-酪蛋白單體產(chǎn)物的質(zhì)譜分析

圖3為生姜蛋白酶在60℃水解κ-酪蛋白單體生成產(chǎn)物的MALDI/TOF-MS圖。質(zhì)譜分析得到κ-酪蛋白水解產(chǎn)物的一系列多肽信號。響應(yīng)信號最強(qiáng)的是質(zhì)荷比為7 069 Da和7 197 Da的2個(gè)多肽信號，這兩個(gè)肽段的質(zhì)荷比與Egito等［6］觀測到小牛皺胃酶水解κ-酪蛋白Phe105-Met106生成的親水性肽段酪蛋白糖巨肽(κ-CN(f106-169)的質(zhì)荷比(6 787.4 Da)相近。通過與κ-酪蛋白C末端肽段的分子質(zhì)量對比發(fā)現(xiàn)，質(zhì)荷比為7 069 Da的肽段與 κ-酪蛋白 C末端Leu103-Val169這條多肽相符;質(zhì)荷比為7 197 Da的肽段可能是κ-CN(f 103-169)帶有1個(gè)磷酸根基團(tuán)(磷酸根基團(tuán)的分子質(zhì)量為95 Da)的分子(表2)。此外，質(zhì)荷比高于10 kDa的信號有3個(gè)，分別為10 556、11 941和14 083 Da的肽段。與圖2c中κ-酪蛋白水解產(chǎn)物電泳圖的結(jié)果一致。為了確定這3條肽段是否為κ-酪蛋白裂解生成的N末端肽段，將電泳凝膠中對應(yīng)κ-CN 1的條帶用胰蛋白酶做膠內(nèi)酶解，酶解液用Q-TOF/MS分析，獲得的肽段序列信息見表3。膠內(nèi)酶切產(chǎn)物中與κ-酪蛋白氨基酸序列相匹配的肽段有4個(gè)，覆蓋率為30%，肽段分子質(zhì)量搜索分值為210(圖4)，與κ-酪蛋白的匹配度顯著(P＜0.05)。因此可以確定κ-CN 1是κ-酪蛋白水解生成的N端肽段，與κ-副酪蛋白類似。從上述分析可知，圖2c中κ-CN(f 1-90)、κ-CN(f1-102)和 κ-CN(f1-121)都是生姜蛋白酶水解κ-酪蛋白生成的N末端肽段。

圖2 不同反應(yīng)時(shí)間下生姜蛋白酶水解酪蛋白的Urea SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Urea SDS-PAGE electrophoregrams of bovine casein fractions by ginger proteases at 5，15，30，60，120，180 min

圖3 κ-CN水解產(chǎn)物MALDI/TOF-MS質(zhì)譜圖Fig.3 MALDI/TOF-MS spectra of κ-casein digests

表2 MALDI-TOF/MS分析生姜蛋白酶水解κ-CN生成的主要產(chǎn)物Table 2 MALDI-TOF/MS analysis of the main products of κ-casein hydrolyzate digested by ginger protease

表3 κ-CN(f 1-121)膠內(nèi)酶解產(chǎn)物的Q-TOF2質(zhì)譜鑒定Table 3 Identification of peptide fragments of in-gel digests of κ-CN(f 1-121)using Q-TOF2

圖4 κ-CN(f 1-121)膠內(nèi)酶解產(chǎn)物的肽段序列在NCBInr數(shù)據(jù)庫中的Mascot檢索結(jié)果圖(圖4中超出陰影區(qū)域的檢索值表示具有統(tǒng)計(jì)意義)Fig.4 Mascot Score histogram of peptide fragments of in-gel digests of κ-CN(f 1-121)searched from NCBInr database(Search scores beyond the shadow area indicating statistically significance)

2.3 脫脂乳凝乳過程中酪蛋白組分的變化

實(shí)際生產(chǎn)中，凝乳酶的作用底物是包含所有酪蛋白組分的復(fù)合底物體系。圖5為生姜蛋白酶對脫脂乳體系中酪蛋白組分的水解作用隨時(shí)間變化的高效液相色譜圖。由于翻譯后修飾(磷酸化和糖基化)的差異κ-酪蛋白在反相色譜分離條件下被分成保留時(shí)間分別為25.90、26.85、27.39和29.51 min 4個(gè)峰。據(jù)報(bào)道κ-酪蛋白的主要組成成分中約40% ～50%是不含糖基化的形式［7-8］，糖基化使 κ-酪蛋白分子的親水性顯著增強(qiáng)［9］，因此保留時(shí)間較短的為糖基化的 κ-酪蛋白［10］。αS2-、αS1-和 β-酪蛋白的保留時(shí)間分別為31.55、37.51和40.57 min，乳清蛋白在最后被分離開來，保留時(shí)間在44.5～48.0 min間的多個(gè)峰組分，這與Bonizzi等報(bào)道的乳蛋白在反相色譜圖中的出峰位置一致［4］。

圖5 酪蛋白組分在不同凝乳時(shí)間下的水解作用Fig.5 Degradation of casein fractions at different incubation time

在牛乳自然pH(pH 6.6)下加入生姜蛋白酶5 min后，κ-酪蛋白即被迅速水解，生成保留時(shí)間為26.28 min的產(chǎn)物，這與 Jaubert和 Martin報(bào)道［11］的RP-HPLC液相色譜圖中κ-副酪蛋白色譜峰緊鄰κ-酪蛋白一致。由此可見，在脫脂乳體系中，也就是通常的凝乳條件下，生姜蛋白酶主要水解κ-酪蛋白，而其他酪蛋白組分沒有被生姜蛋白酶的直接水解。

2.4 生姜蛋白酶在酶解過程中的酶切位點(diǎn)分析

利用等電點(diǎn)沉淀法(調(diào)pH值至4.6)將反應(yīng)體系中的親水性肽段和乳清蛋白去除，排除了其對酪蛋白和疏水性肽在分析中的干擾，有利于對酪蛋白水解產(chǎn)物的分析。如圖6所示，pH 4.6脫脂乳不溶性蛋白中κ-酪蛋白包括保留時(shí)間為39.93、40.38、40.61和41.41 min的4個(gè)組分(圖6a)。在凝乳時(shí)，κ-酪蛋白全部被生姜蛋白酶水解，生成保留時(shí)間在40.1～40.2 min間的產(chǎn)物。通過質(zhì)譜分析得到質(zhì)荷比大于10 kDa的4個(gè)分子離子峰(圖7)。a峰和c峰與κ-酪蛋白單體在pH 6.5磷酸鹽緩沖液中受生姜蛋白酶作用生成的主要水解產(chǎn)物的分子離子峰的質(zhì)荷比相同，分別為κ-CN(f 1-102)和κ-CN(f 1-121)。與之不同的是，牛乳體系中的水解產(chǎn)物含有1個(gè)分子量更大的肽段(d峰)。經(jīng)過與κ-酪蛋白氨基酸序列進(jìn)行分子量對比發(fā)現(xiàn)d峰為κ-酪蛋白N末端1-124肽段，即κ-CN(f 1-124)。從生姜蛋白酶水解κ-酪蛋白的肽鍵位置來看，生姜蛋白酶水解P2位是脯氨酸的肽鍵的專一性較高。

圖6 生姜蛋白酶水解酪蛋白的RP-HPLC色譜圖Fig.6 RP-HPLC chromatograph of whole casein(a)，pH 4.6 insoluble fraction of the coagulum at milk pH 6.6(b)

3 結(jié)論

圖7 類κ-副酪蛋白HPLC色譜峰組分的質(zhì)譜圖Fig.7 MALDI-TOF/MS spectra of RP-HPLC peak fraction of para-κ-CN like peptides

通過分析可以發(fā)現(xiàn)，在磷酸鹽緩沖液中，αS1-、αS2-和β-CN單體易被生姜蛋白酶水解。而在脫脂乳體系中，生姜蛋白酶對αS1-、αS2-和κ-CN的水解作用很小，而κ-CN被快速水解生姜蛋白酶水解，主要生成兩個(gè)N末端產(chǎn)物κ-CN(f 1-90)和κ-CN(f 1-102)。這反映出在牛乳膠體體系中，κ-CN處在酪蛋白微粒的外圍，被生姜蛋白酶水解之后仍保留在酪蛋白微粒的表面，使 αS1-、αS2-和 β-CN免受蛋白酶的直接水解。生姜蛋白酶凝乳的機(jī)理主要是通過水解κ-酪蛋白Thr121-Ile122肽鍵，破壞了酪蛋白微粒的穩(wěn)定性，促使酪蛋白凝結(jié)形成凝膠。

［1］ Shammet K M，Brown R J，McMahon D J.Proteolytic activity of some milk-clotting enzymes on κ-casein［J］.Journal of Dairy Science，1992，75(6):1 373-1 379.

［2］ Horne D S，Banks J M.Rennet-induced coagulation of milk［M］.London:Chapman and Hall，2004:47-70.

［3］ Andrews A T.Proteinases in normal bovine milk and their action on caseins［J］.Journal of Dairy Research，1983，50(1):45-55.

［4］ Bonizzi I，Buffoni J N，F(xiàn)eligini M.Quantification of bovine casein fractions by direct chromatographic analysis of milk.Approaching the application to a real production context［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216(1):165-168.

［5］ Hayaloglu A A，Guven M，F(xiàn)ox P F.Influence of starters on chemical，biochemical，and sensory changes in Turkish white-brined cheese during ripening［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(10):3 460-3 474.

［6］ Egito A S，Girardet J M，Laguna L E，et al.Milk-clotting activity of enzyme extracts from sunflower and albizia seeds and specific hydrolysis of bovine α-casein［J］.International Dairy Journal，2007，17(1):816-825.

［7］ Vreem H J，Visser S，Slangen C J，et al.Characterization of bovine κ-casein fractions and the kinetics of chymosininduced macropeptide release from carbohydrate-free and carbohydrate-containing fractions determined by high-per-formance gel-permeation chromatography［J］.Biochemistry Journal，1986，240(1):87-97.

［8］ Farrell H M，Jimenez-Flores R，Bleck GT，et al.Nomenclature of the proteins of cow’s milk-sixth revision［J］.Jouranal of Dairy Science，2004，87(6):1 641-1 674.

［9］ Fox P F，McSweeny P L H.Cheese:An overview［M］.London:Chapman and Hall，2004:1-18.

［10］ Elgar D F，Carmen S N，Ayers J S，et al.Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene［J］.Journal of Chromatography A，2000，878(2):183-196.

［11］ Jaubert A，Martin P.Reverse-phase HPLC analysis of goat caseins.Identification of αS1and αS2genetic variants［J］.Lait，1992，72(3):235-247.