貨架期內液態(tài)奶中結合型羥甲基糠醛生成的動力學分析*

曹婉秀，仇凱，鐘其頂，熊正河，呂曉玲

1(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津，300457) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

3(全國食品發(fā)酵標準化中心，北京，100015)

食品貨架期(保質期)指在標簽規(guī)定的條件下，保持食品質量(品質)的期限，并保持標簽中不必說明或已經說明的特有品質。在此期限內，食品能夠保持安全，確保理想的感官、理化和微生物特性，適于銷售。液態(tài)奶加工過程中通常使用巴氏殺菌、保持滅菌、超高溫瞬時滅菌等熱處理工藝來保證產品安全和貨架期，但是加熱不可避免地會導致美拉德反應的發(fā)生，對產品的顏色［1-3］、風味［4］和營養(yǎng)價值［5-7］造成一定影響。通常在UHT處理過程中發(fā)生的美拉德反應處于早期階段，僅造成賴氨酸的部分損失;而在產品貯存階段發(fā)生的高級或終級美拉德反應有可能導致產品顏色和風味的變化［8-9］。因此，研究并控制乳制品貨架期內的美拉德反應程度，對提高乳制品品質具有十分重要的意義。

乳制品貨架期內美拉德反應的動力學分析可以反映乳制品產品品質的變化。本文采用市售液態(tài)乳(去乳糖型和未去乳糖型)，并考慮包裝、貯存溫度、和貯存時間影響因素，針對美拉德反應高級階段產生的結合型羥甲基糠醛(B-HMF)生成因素進行動力學分析。HMF是最早用于評價牛奶熱處理強度的指示物之一［10］，其含量越高，說明蛋白質品質降低越明顯，有2種產生途徑——乳糖異構化產物降解和美拉德反應［11］。B-HMF是僅由Amadori產物酸水解得到的［12］，選擇它作為研究對象可排除乳糖異構化對美拉德反應動力學研究的干擾。

1 材料與方法

1.1 樣品、試劑與儀器

樣品:同一品牌的3種UHT液態(tài)奶產品:百利包、利樂包(2種純牛奶以及利樂包低乳糖奶。樣品編號及各組分含量(g/100 mL)如表1所示。

表1 樣品編號及樣品中各組分含量Table 1 The samples’numbers and composition of main components in the samples

試劑:草酸，北京化工廠;三氯乙酸，天津市福晨化學試劑廠;二氯甲烷，西隴化工股份有限公司;以上試劑均為分析純。HMF標準品，純度≥98%，Sigma;甲醇為色譜純。

儀器:WATERS 2695高效液相色譜儀，美國沃特世公司;WATERS 2998二極管陣列檢測器，美國沃特世公司;HC-3518高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司;渦旋振蕩器WH-861，太倉市科教器材廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品貯存

所有樣品分別貯存在4℃冰箱、25℃和37℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.2 HPLC法標準溶液的配制

HMF標準儲備液:準確稱取HMF標準品10.56 mg，用甲醇定容至25 mL，得到濃度為0.105 6 mg/mL的標準儲備液，貯存于4℃冰箱。

標準工作液:準確吸取HMF標準儲備液1.00 mL，用甲醇定容至10 mL，得到濃度為10.56 μg/mL的工作液。

1.2.3 樣品前處理

量取5 mL樣品于10 mL離心管中，加入2 mL 40%三氯乙酸(TCA)溶液，漩渦振蕩2～3 min充分混勻，8 000 g離心15 min，倒出上清液，沉淀中加入3mL 4%的TCA溶液，充分搖勻，8 000 g離心15 min，倒出上清液。向沉淀中加入3 mL 1.07 mol/L的草酸溶液，100℃下水浴240 min。水解后的樣品中加入2 mL 40%的TCA，充分搖勻后8 000 g離心15 min，收集上清液，沉淀中加入3 mL 4%的TCA，充分搖勻后8 000 g離心15 min，收集上清液，合并2次的上清液后用流動相定容至10 mL，用0.22 μm膜過濾后待測。

1.2.4 高效液相色譜條件

流動相:V(甲醇)∶V(水)=15∶85，等度洗脫;色譜柱:C18-ODS反相液相色譜柱;紫外檢測器波長:284 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件處理實驗數(shù)據(jù):單因素方差分析、皮爾森系數(shù)以及相依樣品t檢驗。

2 結果與討論

2.1 不同包裝液態(tài)奶貯存過程因素對B-HMF含量的影響分析

乳制品中美拉德反應分為初級、中級和高級3個階段，HMF是常用的美拉德反應中級階段的指示指標之一［13-14］。由表2結果可看出，貯存過程中HMF含量隨著貯存溫度和時間的增加而升高。對于百利包純牛奶，4、25、37℃貯存時，貨架期末期，B-HMF 含量分別增加了30.57%、80.83%、157%;對于利樂包純牛奶，4、25、37℃貯存時，貨架期末期，B-HMF 含量分別增加了140%、280%、628%;對于利樂包低乳糖奶，4、25、37℃貯存時，貨架期末期，B-HMF 含量分別增加了143%、526%、1 131%。

表2 不同溫度下貯存的液態(tài)奶產品中B-HMF含量Table 2 B-HMF contents in liquid milk products storing at different temperatures

2.2 液態(tài)奶貯存過程中B-HMF生成的動力學分析

如圖1所示，樣品1中B-HMF含量隨貯存時間的延長而呈線性增長趨勢，且二者間線性相關顯著(P＜0.05)。事實上，其他樣品中的B-HMF含量也具有相同的趨勢，表明各樣品貯存過程中B-HMF含量的變化整體上都遵循零級反應模式，但許多文獻中稱其為偽零級反應模式［15-16］。即若以B-HMF含量為縱坐標，以貯存時間為橫坐標作圖，可得到一條直線，該直線的斜率即為A280nn或B-HMF含量變化的速率。根據(jù)Arrhenius(阿倫尼烏斯)方程:

式中:k為速率常數(shù);A為指前因子，又稱頻率因子;Ea為表觀活化能，單位J或kJ;R為摩爾氣體常量，R=(8.314 510±0.000 070)J/(mol·K);T 為熱力學溫度，單位K。

圖1 樣品1中B-HMF含量與貯存時間的關系Fig 1 The relationship between B-HMF content in sample 1 and storage time

以lnk對1/T作圖得一直線，直線斜率為-Ea/R，截距為lnA。將Ea和A帶入阿倫尼烏斯公式，可求得速率常數(shù)k，從而求得貯存過程中B-HMF含量隨時間和溫度變化的動力學模型。

表3中列出了與各樣品相對應的阿倫尼烏斯參數(shù)(即阿倫尼烏斯公式中的 lnA、Ea等)［17］和 B-HMF含量變化的動力學模型。為檢驗各模型預測值與實際值的擬合情況，在貯存6～8個月時取樣檢測BHMF含量，結果發(fā)現(xiàn)模型預測值與實際值的相對誤差不超過14%;以樣品3為例，在4℃下貯存6個月時的取樣檢測值為42.32 μg/mL，模型預測值為42.55 μg/mL，則模型預測的相對誤差僅為0.5%。結果顯示，表3中所得的動力學模型較為真實地反映了B-HMF的生成規(guī)律。

對在不同溫度下貯存的樣品1中B-HMF含量進行t檢驗分析，結果表明貯存7 d后，不同溫度下貯存的同種樣品中B-HMF含量間即開始出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05);單因素方差分析結果也可得出相同的結論(P＜0.05)。同理對樣品2和樣品3數(shù)據(jù)進行t檢驗和單因素方差分析，結果均表明:在貯存30 d之后，不同溫度下貯存的同種樣品中B-HMF含量間即開始出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)。表明貯存溫度對樣品中美拉德反應程度的影響十分顯著，這與Jimenez-Pérez等［18］、Soledad Albalá 等［19］的研究結論一致。

如表2所示，低乳糖奶中B-HMF含量要比利樂包的純牛奶中的初始含量高得多。在同一溫度下貯存相同時間后，低乳糖奶中B-HMF含量的增加量遠高于純牛奶(約2～5倍)。這是由于低乳糖奶中的乳糖被酶解為葡萄糖和半乳糖，二者均為單糖，參與美拉德反應的活性比乳糖高［20］。由此可見，盡管從營養(yǎng)學角度上講，低乳糖奶可以緩解人體的乳糖不耐癥，但在蛋白質品質上，低乳糖奶可加快蛋白質營養(yǎng)效價的降低。此外，貯存28 d后的百利包純牛奶與同一溫度下貯存30 d的利樂包純牛奶相比，前者中B-HMF含量增加量更高，表明百利包包裝對貯存過程中美拉德反應程度的貢獻度高于利樂包包裝。

表3 各液態(tài)奶樣品的阿倫尼烏斯參數(shù)及動力學模型Table 3 Arrhenius Parameters and kinetic/equations for liquid milk samples

3 展望

液態(tài)乳中B-HMF含量與貯存溫度和時間之間的關系符合阿倫尼烏斯動力學模型，可據(jù)此模型預測一定溫度下貯存的樣品中B-HMF含量的變化。同一類型產品在貨架期內B-HMF含量變化顯示了蛋白質在貨架期內的品質變化程度，該指標可作為食品中蛋白質質量變化的指示物，通過對3類典型產品的分析，建議液態(tài)乳應盡量在冷鏈條件下銷售。本實驗的后續(xù)工作將對各類乳制品或含蛋白類食品進行研究，為建立食品中蛋白質品質評價指標體系奠定基礎。

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