perR基因的敲除對丙酮丁醇梭菌搖瓶發(fā)酵的影響*

裴建新，龐浩，左文樸，林麗華，郭媛，嚴少敏，黃日波，2

1(廣西科學(xué)院國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，廣西南寧，530007)

2(廣西大學(xué)微生物及植物遺傳工程教育部重點實驗室，廣西南寧，530003)

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)為專性厭氧的梭狀芽孢桿菌，是生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的主要菌株［1-2］。由于缺乏氧化磷酸化作用和細胞色素系統(tǒng)，只能依靠發(fā)酵過程中底物水平磷酸化獲得生命所需的能量。厭氧微生物細胞內(nèi)沒有超氧化合物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶，在有氧氣存在的條件下細胞內(nèi)容易產(chǎn)生O2-，而 O2-反應(yīng)力極強，性質(zhì)不穩(wěn)定，可破壞各種重要高分子和膜，也可形成其他活性氧化物，故對細胞傷害很大［3-4］。

提高丁醇生產(chǎn)菌株的耐氧能力是提高丁醇產(chǎn)量的關(guān)鍵措施之一［5］。Kanysi和Dulky研究了氧氣對1株產(chǎn)丁醇梭菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)在好氧的條件下菌體的生長完全受到抑制［6］。Morris曾經(jīng)研究了氧氣對C.acetobutylicum生長和代謝的影響，發(fā)現(xiàn)將C.acetobutylicum短期與氧氣接觸是非致命的，但是當氧氣的濃度達到一定值后葡萄糖的消耗速率下降，DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成停止，同時也導(dǎo)致芽孢形成的加劇［7］。2008年Hillmann研究了在丙酮丁醇梭菌perR基因敲除后，突變菌株赤鮮素蛋白和熱激蛋白等蛋白質(zhì)的過量表達，導(dǎo)致提高了菌株對氧氣和超氧化物的耐受能力［8］。

Ⅱ組內(nèi)含子普遍存在于各種生物基因組中，經(jīng)過修飾可應(yīng)用于基因敲除技術(shù)方法，通過隨機選擇EBS序列產(chǎn)生內(nèi)含子，該內(nèi)含子能位點專一性地插入任何靶點［9-10］。本研究應(yīng)用Ⅱ組內(nèi)含子敲除技術(shù)敲除丙酮丁醇梭菌perR(超氧化物阻遏蛋白)基因，對突變菌株進行搖瓶發(fā)酵試驗，突變菌株提高了對分子氧的耐受能力，降低厭氧環(huán)境要求，在生產(chǎn)發(fā)酵過程中可降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 824購于美國模式培養(yǎng)物集存庫，pSY6載體，中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所楊琛研究員饋贈，E.coli JM109，本實驗室保存。

1.1.2 酶和試劑

TargetronTMGene Knockout System Kit試劑盒、Primer STAR DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、各種限制性內(nèi)切酶及λDNA/Hind III DNA Marker為大連TaKaRa寶生物工程公司產(chǎn)品;T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BsrG I和Xho I購自MBI Fermentas公司;小量膠回收試劑盒及小量DNA純化試劑盒Omega biotek公司產(chǎn)品;PCR引物合成和測序委托上海捷瑞生物公司完成;其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

TYA培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 6.0，牛肉膏 2.0，酵母膏 2.0，葡萄糖 40.0，乙酸銨 3.0，KH2PO40.5，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:含60 g/L葡萄糖的TYA培養(yǎng)基。

抗性篩選培養(yǎng)基:在含20 g/L瓊脂粉的TYA培養(yǎng)基中添加100 μg/mL的紅霉素。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR克隆perR-Targetron基因片段及pSY-perR敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

參考TargetronTMGene Knockout System Kit提供的方法，分別設(shè)計引物 perR238/239-IBS、perR238/239-EBS1d和 perR238/239-EBS2，還有 TargetronTMGene Knockout System Kit中通用引物IBS，以這4條為PCR引物，模板試劑盒帶有，PCR克隆獲得350 bp perR-Targetron片段，用于構(gòu)建pSY-perR敲除質(zhì)粒。引物perR-rev-a238/239和perR-for-a238/239用于驗證敲除菌株，試驗引物如表1。

表1 引物名稱和序列Table 1 Primers of sequence

質(zhì)粒pSY6和perR-Targetron DNA分別用內(nèi)切酶BsrG I和Xho I消化，純化后用T4DNA連接酶構(gòu)建pSY-perR敲除質(zhì)粒。

1.2.2 敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化C.acetobutylicum

C.acetobutylicum感受態(tài)細胞的制備參照文獻［11］，將200 μL感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)入0.2 cm 電轉(zhuǎn)化杯中，加入質(zhì)粒約1 μg進行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件:電壓1 500 V，電流 25 μF，電阻 2 000 Ω，電擊時間 8 ～10 ms。電擊后立即加入1 mL TYA培養(yǎng)基厭氧預(yù)培養(yǎng)2 h，涂布含100 μg/mL紅霉素抗性的TYA平板，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 perR突變菌株的篩選驗證及抗性消除

PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子，將陽性轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物委托上海捷瑞生物公司完成，測序正確后轉(zhuǎn)接入不含紅霉素抗性的TYA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)5次，依次對應(yīng)點含紅霉素抗性平板和空白板，篩選出抗性板不生長，空白板生長的單菌落進行下一步發(fā)酵試驗。

1.2.4 突變菌株搖瓶發(fā)酵試驗

試驗菌株經(jīng)TYA平板培養(yǎng)基活化后，挑單菌落到TYA液體培養(yǎng)基中37℃靜止培養(yǎng)至OD600為1左右作為發(fā)酵種子液，按5%體積比接種量轉(zhuǎn)接到裝100 mL TYA培養(yǎng)基的250 mL容量三角瓶中，37℃發(fā)酵 60 h，進行產(chǎn)物檢測［12］。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物分析

發(fā)酵產(chǎn)物用Agilent 6890氣相色譜儀分析檢測。

色譜條件:檢測器，F(xiàn)ID(220℃);色譜柱，phenomen ZB-WAXplus;柱箱溫度，100℃;進樣口壓力，116.66 kPa;氫氣流量，30 mL/min;進樣量，0.2 μL。利用正丙醇作為內(nèi)標進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 perR-Targetron基因片段的克隆、重組質(zhì)粒pSY-perR的構(gòu)建及驗證

以 perR238/239-IBS、perR238/239-EBS1d、perR238/239-EBS2，和通用引物 IBS這 4條為 PCR引物，pACD4K-C vector作為模板PCR克隆獲得350bp perR-Targetron片段，線性化的pSY-6載體片段(圖1)。

質(zhì)粒pSY6和perR-Targetron DNA分別用內(nèi)切酶BsrG I和Xho I消化，純化后用T4DNA連接酶構(gòu)建pSY-perR敲除質(zhì)粒(如圖2所示)。將構(gòu)建好的pSY-perR敲除質(zhì)粒委托上海捷瑞生物公司完成。測序驗證正確的敲除質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化C.acetobutylicum。

2.2 敲除菌株 C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR的篩選以及驗證

將重組質(zhì)粒pSY-perR利用電擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入菌株C.acetobutylicum，涂布到含有紅霉素抗性的平板上，重組質(zhì)粒在C.acetobutylicum細胞里可將Ⅱ組內(nèi)含子目的片段定點整合到染色體上。通過菌落基因組PCR鑒定篩選成功敲除的菌株C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR。將篩選得到的敲除菌株菌體基因組作為模板，以perR-rev-a238/239和perR-for-a238/239為驗證引物進行菌落PCR擴增，原始菌株perR基因PCR產(chǎn)物長度為350bp，敲除菌株P(guān)CR產(chǎn)物長度為1000bp(如圖3所示)。與預(yù)期的結(jié)果一致，經(jīng)PCR產(chǎn)物測序表明成功敲除，將敲除菌株培養(yǎng)消除抗性。

圖1 PCR擴增的perR-Targetron基因和線性化pSY6載體片段凝膠電泳圖Fig.1 The electrophoris results of perR-Targetron and plasmid pSY-perR

圖2 質(zhì)粒pSY-perR的構(gòu)建物理圖譜Fig.2 Physical map of plasmid pSY-perR

2.3 敲除菌株 C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR搖瓶發(fā)酵試驗

氧氣對C.acetobutylicum發(fā)酵生產(chǎn)丁醇有明顯的抑制作用，試驗通過不同搖床速度(0、50、100、150和200 r/min)控制通氣量，考察氧氣對突變菌株C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR 和 對 照 菌 株C.acetobutylicum ATCC 824的生長曲線和發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的影響，定時測定培養(yǎng)液中的生物量，以O(shè)D600值作為縱坐標，生長時間作橫坐標作圖，反映菌株在不同環(huán)境條件下群體的生長規(guī)律如圖4和圖5所示。

圖3 突變菌株P(guān)CR驗證電泳圖Fig.3 The electrophoris results of PCR products

圖 4 C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR菌株的生長曲線Fig.4 Growth curve of C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR

圖5 C.acetobutylicum ATCC 824菌株的生長曲線Fig.5 Growth curve of C.acetobutylicum ATCC 824

由圖 4可知，C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR菌株隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加生物量變化不大，圖5顯示C.acetobutylicum ATCC 824菌株在搖床轉(zhuǎn)速達到150 r/min時生物量明顯下降，生長受到抑制，試驗表明敲除C.acetobutylicum ATCC 824的perR基因后菌株對氧氣的傷害減小。

試驗通過不同搖床轉(zhuǎn)速測定丁醇發(fā)酵的變化，發(fā)酵結(jié)束后氣相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物，試驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對丁醇發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of different shaker＇s rotating speed on butanol fermentation

由圖6可知，靜止狀態(tài)發(fā)酵丁醇C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR 比 C.acetobutylicum ATCC824丁醇產(chǎn)量提高7.89%，C.acetobutylicum ATCC 824發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的濃度隨著轉(zhuǎn)速的增加而減少，C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的濃度隨著轉(zhuǎn)速的增加沒有明顯的變化，轉(zhuǎn)速為200 r/min時C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR的丁醇產(chǎn)量是C.acetobutylicum ATCC 824的3.34倍。

3 結(jié)論

使用Ⅱ組內(nèi)含子敲除系統(tǒng)獲得perR基因缺陷型菌株 C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加生物量變化不大，而原始菌株C.acetobutylicum ATCC 824在搖床轉(zhuǎn)速達到150 r/min時生物量明顯下降，生長受到抑制。靜止狀態(tài)發(fā)酵 丁 醇 C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR 比C.acetobutylicum ATCC 824丁醇產(chǎn)量提高7.89%，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR的丁醇產(chǎn)量是C.acetobutylicum ATCC 824的3.34倍。試驗結(jié)果表明C.acetobutylicum ATCC 824敲除perR基因后對氧的耐受性有一定作用，降低氧的毒害。根據(jù)文獻［8］報道突變菌株C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR赤鮮素蛋白和熱激蛋白等蛋白質(zhì)的過量表達，菌株對氧氣和超氧化物的耐受能力提高;文獻［13］報道，C.acetobutylicum熱激蛋白的過量表達，可提高丁醇的產(chǎn)量和丁醇的耐受能力;文獻［3］報道敲除perR基因后突變菌株的赤鮮素蛋白和紅素氧還蛋白過量表達使NADH過氧化物酶和NADH氧化酶活力至少提高了10倍，在細胞電子鏈傳遞過程中，電子的最終受體不是氧分子，而是過氧化氫，減少氧分子的消耗，沒有改變NADH和NAD+的比例，不會降低合成丁醇的還原力。C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR在發(fā)酵生產(chǎn)丁醇過程中不需要利用混合氣體或者化學(xué)方法來制造無氧環(huán)境，在發(fā)酵生產(chǎn)過程中降低成本。

Ⅱ組內(nèi)含子敲除系統(tǒng)獲得的突變菌株其突變發(fā)生在染色體水平上，因而遺傳穩(wěn)定，抗性容易消除，在發(fā)酵中無需添加抗生素以保證其存在優(yōu)勢，可以構(gòu)建多個突變基因的工程菌株來提高丁醇產(chǎn)量。C.acetobutylicum perR基因的敲除，可以提高菌株對氧分子的耐受能力，降低嚴格厭氧環(huán)境要求，使得發(fā)酵工藝簡單，此方法為更多厭氧菌株改造奠定了理論基礎(chǔ)。

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