檳榔乙醇提取物對豬雞五種致病菌的抑菌作用初探

周璐麗 王定發(fā) 周漢林 侯冠彧 李韋

摘 要 采用倍比稀釋法，評價了檳榔青果的乙醇提取物對豬雞養(yǎng)殖中常見致病菌的抗菌作用。結(jié)果表明：提取物對雞大腸桿菌、雞沙門氏菌、雞金黃色葡萄球菌、豬大腸埃希菌、豬金黃色葡萄球菌等5種致病菌有一定的抑菌作用，最低抑菌濃度（MIC）分別為62.5、31.25、31.25、62.5、62.5 g/L，而最低殺菌濃度（MBC）分別為125、62.5、62.5、125、125 g/L。

關(guān)鍵詞 檳榔提取物 ；大腸桿菌 ；沙門氏菌 ；金黃色葡萄球菌 ；最低抑菌濃度 ；最低殺菌濃度

分類號 S852.61 ；R285.5

檳榔屬于棕櫚科植物，為中國五大南藥之首，主要產(chǎn)于我國海南、廣東、廣西、云南、福建和臺灣等地。檳榔主要含有生物堿、鞣質(zhì)、油脂等化學成分[1]，具有殺蟲消積、降氣等功效，是常用的驅(qū)蟲、消積藥物，對于腸道寄生蟲、痢疾腹瀉、腳氣腫脹等具有較好的療效[2]。目前相關(guān)研究大多集中于檳榔提取物的驅(qū)蟲作用[3-5]、抗氧化[6-8]、促進胃腸道蠕動[9]等方面。

腸毒性大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌是較常見的引起人類和畜禽細菌性腸道疾病的致病菌，嚴重危害人類和動物的安全。隨著我國畜禽養(yǎng)殖的發(fā)展，畜禽腸道致病菌多重感染、抗生素長期大量使用帶來的畜產(chǎn)品安全問題日益突出，因此急需開發(fā)抗菌活性高、低毒性、低殘留、廣譜的飼料添加劑以提高畜禽腸道細菌多重感染性疾病的控制水平。目前對檳榔抗細菌，特別是常見的腸道致病菌方面研究較少。本研究針對豬雞生產(chǎn)中常見的幾種致病菌（豬、雞大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞沙門氏菌），探討檳榔乙醇提取物的體外抑菌效果，為開發(fā)以檳榔提取物為主的飼料添加劑應(yīng)用于豬雞養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

檳榔（Areca catechu）青果采自儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶植物園。氫溴酸檳榔堿標準品購自中國食品藥品檢定研究院。雞大腸桿菌（CVCC249）、雞沙門氏菌（CVCC533）、雞金黃色葡萄球菌（CVCC1885）、豬大腸埃希菌（CVCC224）、豬金黃色葡萄球菌（CVCC546）標準菌株，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檳榔提取物制備

將檳榔青果切開，65℃烘干，粉碎。稱取50 g烘干粉碎樣，加入700 mL 85%乙醇，85℃，熱回流提取2 h，減壓抽濾，得濾液后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏，用丙酮定容至50 mL，即得1000 g/L溶液（按原料算），用一次性濾菌器過濾除菌。

1.2.2 菌懸液制備

將5種菌株分別接種到2 mL滅菌營養(yǎng)肉湯試管中進行純培養(yǎng)。取0.5 mL純培養(yǎng)后菌懸液，加入到4.5 mL的滅菌營養(yǎng)肉湯中，依次進行10倍倍比稀釋，采用10-5、10-6、10-7和10-8濃度涂板，每個濃度3個平行，選取菌落數(shù)在30～300之間進行計數(shù)。算得菌懸液濃度后，將其配制成10×105 CFU/mL試驗菌液。

1.2.3 檳榔提取物中檳榔堿含量測定

參照劉文杰（2012）[10]方法，采用比色法測定檳榔提取物中檳榔堿的含量。

1.2.4 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）測定

采用試管倍比稀釋法，取24支試管，分為3組，每組8支。用移液槍吸取1 mL滅菌營養(yǎng)肉湯于每支試管，再于每組第1支試管加入1 mL檳榔提取物溶液（1000 g/L），搖勻，然后再從每組第1管吸取1 mL混合溶液加入第2支試管，混勻后，再從第2支試管吸取1 mL混合溶液加入第3支試管，依次類推一直到第6管，再從第6管吸取1 mL混勻液去掉。第7管為陽性對照，第8管為陰性對照。將1 mL 10×105 CFU/mL試驗菌液分別加入到上述各管中，陰性對照加入1 mL滅菌營養(yǎng)肉湯?；靹蚝螅瑢⑸鲜鲈嚬芊湃?7℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

按照文獻[11]判定最低抑菌濃度（MIC）：首先觀察細菌陽性對照組長菌呈渾濁狀態(tài)，而陰性對照組不長菌呈透明清亮狀的前提下，觀察各濃度組的渾濁情況，以判斷不同濃度檳榔提取物的抑菌作用。如試管內(nèi)呈嚴重渾濁，表明有細菌生長，用“++”表示；如輕微渾濁，用“+”表示；如試管內(nèi)透明清亮，表明無細菌生長，用“-”表示。

1.2.5 最低殺菌濃度（minimal bacteriocidal concentration，MBC）測定

吸取上述澄清透明的的各試管培養(yǎng)物0.2 mL，將含有雞和豬大腸桿菌的培養(yǎng)物接種到麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)板上；含有雞沙門氏菌的試管培養(yǎng)物接種到SS瓊脂培養(yǎng)基上，含有金黃色葡萄球菌試管培養(yǎng)物接種到Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，每個試管接種到3個培養(yǎng)基作為重復(fù)，編號，37℃培養(yǎng)24 h，觀察有無細菌生長，以培養(yǎng)板上計數(shù)少于5個菌落作為對應(yīng)的試管內(nèi)藥物濃度為該菌株的最低殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔提取物中檳榔堿含量

測得檳榔干粉中檳榔堿含量為0.37%，提取物溶液1000 g/L溶液（按原料算）中檳榔堿濃度為3.7 g/L。

2.2 檳榔提取物對幾種致病菌的抑菌效果

不同濃度檳榔提取物對幾種畜禽致病菌株的抑菌效果見表1。結(jié)果表明，檳榔提取物對雞沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的MIC 為31.25 g/L，對雞大腸桿菌、豬大腸埃希菌、豬金黃色葡萄球菌的MIC為62.5 g/L。

檳榔提取物對幾種畜禽致病菌株的最低殺菌濃度見表2。結(jié)果表明，檳榔提取物雞沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的MBC 62.5 g/L，對雞大腸桿菌、豬大腸埃希菌、豬金黃色葡萄球菌的MBC 125 g/L。

3 討論與結(jié)論

由于產(chǎn)地和品種的不同，檳榔中檳榔堿含量略有差異，一般檳榔中檳榔堿含量為0.3%～0.6%[12]，在本次試驗中通過分光光度法測得檳榔中檳榔堿含量為0.37%。

黃玉林等研究了采用索式提取法提取的檳榔提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、米曲霉、黃曲霉6種菌的體外抗菌作用。結(jié)果表明，檳榔提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌作用，對釀酒酵母、米曲霉、黃曲霉沒有抗菌作用[13]。劉文杰等采用雙層平板打孔法研究了檳榔殼乙醇提取物對食品中幾種常見的的細菌和真菌的抑制作用。結(jié)果表明，檳榔殼乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌的MIC分別為8.75、4.375、35和35 g/L，而對真菌釀酒酵母、黑曲霉、根霉沒有抑制作用[10]，其對大腸桿菌的MIC與本試驗中對雞大腸桿菌的MIC較為接近。本試驗中，檳榔提取物雞沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及豬大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的MIC分別為62.5、31.25、31.25、62.5和62.5 g/L，表明檳榔提取物對雞大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用。對雞和豬金黃色葡萄球菌的MIC的差異，可能由于金黃色葡萄球菌菌株的宿主不同而導(dǎo)致的耐藥性差異導(dǎo)致。

大腸桿菌、沙門氏菌、大腸埃希菌等致病菌感染動物后主要造成消化道疾病，如新生幼畜腹瀉、痢疾等。而致病性金黃色葡萄球菌感染動物后會引起局部化膿感染以及敗血癥等。眾所周知，抗生素添加劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中長期、大量使用造成藥物殘留，已嚴重影響到畜產(chǎn)品的質(zhì)量，另外抗生素的濫用導(dǎo)致嚴重多重耐藥與交叉耐藥。植物提取物本身具有低毒、低殘留、低耐藥性，是抗生素所不具備的。而且植物提取物往往并不僅體現(xiàn)在抑菌方面，更重要的是植物提取物中含有的多種活性成分能夠調(diào)動動物機體的免疫力，達到抵抗病原微生物的目的。因此，開發(fā)植物飼料添加劑具有重要的意義。本次研究表明，檳榔乙醇提取物對五種豬雞主要致病菌具有一定的抑制作用，且對雞大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，其MIC為31.25 g/L，但對一些耐藥菌株及不同提取成分的抑菌機理還有待進一步研究。

參考文獻

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