兔眼內(nèi)窺鏡下睫狀體光凝聯(lián)合白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)對房水成分的影響△

張運(yùn)江 俞方良 劉淼 金洪堯 黃國富

我國青光眼致盲的人數(shù)占全體盲人的5.3%～21.0%，青光眼已成為我國當(dāng)前的主要致盲眼病之一［1］。而白內(nèi)障所致盲的人數(shù)占全體盲人中的56.7%，是我國首位致盲原因［2］。青光眼與白內(nèi)障都是眼科的常見疾病，國外報道接受白內(nèi)障手術(shù)的患者中存在青光眼的比例達(dá)30%［3］。

Uram首先于眼內(nèi)窺鏡直視下對難治性青光眼進(jìn)行激光睫狀體光凝手術(shù)［4-5］;隨著對內(nèi)窺鏡睫狀體光凝(endoscopic cyclophotocoagulation，ECP)的進(jìn)一步研究，ECP聯(lián)合白內(nèi)障超聲乳化術(shù)(Phaco)逐漸成為合并有白內(nèi)障的青光眼患者治療新方向，這種方法可以避免目前白內(nèi)障手術(shù)聯(lián)合青光眼濾過性手術(shù)的一些缺陷［6－7］。而青光眼聯(lián)合白內(nèi)障三聯(lián)手術(shù)后最常見的并發(fā)癥為虹膜睫狀體的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為前房房水混濁以及纖維蛋白滲出和人工晶狀體前膜的形成，其發(fā)生率比單純的白內(nèi)障手術(shù)高。本研究觀察不同的睫狀體光凝范圍、不同的聯(lián)合手術(shù)對房水蛋白質(zhì)濃度、TNF-α和IL-1β含量的影響，進(jìn)一步了解手術(shù)對血-房水屏障的破壞、前房炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 動物來源于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，選擇30只(60眼)健康成年灰兔，雌雄不限，體質(zhì)量 2.0～2.2 kg，雙眼前檢查及眼底、眼壓檢查正常。

1.2 慢性青光眼模型制作 30只(60眼)灰兔制作慢性青光眼模型，用激光通過外路對角鞏膜緣小梁網(wǎng)組織進(jìn)行一圈360°照射，激光光斑200 μm、功率500 mW、曝光時間 0.7 s、間隔時間 0.5 s，光束聚集于小梁網(wǎng)中后部灰色帶，激光后可見小梁網(wǎng)區(qū)域變白和形成小氣泡。以連續(xù)1周測量眼壓≥25 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)為慢性青光眼建模成功標(biāo)準(zhǔn)，成功建立的24只(48眼)灰兔隨機(jī)分成A組、B組、C組、對照組(D組)，每組各6只(12眼)。A組、B組、C組建模1周后在全身麻醉下行ECP+Phaco+IOL 手術(shù)，三組分別進(jìn)行 180°、270°、360°睫狀體光凝;D組在全身麻醉下行小梁切除(trabeculectomy，TRAB)+Phaco+IOL手術(shù)。

1.3 方法

1.3.1 ECP+Phaco+IOL手術(shù) 將 A組、B組、C組灰兔俯臥位固定于兔臺，按1.5 mL·kg－1的水合氯醛注射液于腹部皮下注射進(jìn)行全身麻醉，同時用愛爾卡因眼液表面麻醉。用復(fù)方托吡卡胺眼液滴眼，每5 min 1次，共3次，散大瞳孔。常規(guī)洗眼、消毒、鋪巾，開瞼器開瞼，生理鹽水沖洗結(jié)膜囊。

11點鐘位做3.2 mm的透明角膜切口，3點鐘位做輔助角膜切口，前房內(nèi)注入透明質(zhì)酸鈉、撕囊、水分離、水分層、超聲乳化晶狀體核、I/A注吸晶狀體皮質(zhì)、前后房內(nèi)注入透明質(zhì)酸鈉。連接好內(nèi)窺鏡系統(tǒng)，探頭先從11點鐘位主切口進(jìn)入，對要進(jìn)行270°和360°范圍睫狀體光凝眼擴(kuò)大3點鐘位切口、從3點鐘位切口進(jìn)入。內(nèi)窺鏡探頭進(jìn)入后房達(dá)虹膜與前囊膜之間，觀察睫狀突，調(diào)節(jié)焦點對準(zhǔn)睫狀突進(jìn)行光凝，睫狀突的前后部分均應(yīng)接受光凝，激光能量0.2 mV、連續(xù)光凝，對每個睫狀突光凝達(dá)到變白、塌陷、皺縮為光凝程度標(biāo)準(zhǔn)，避免達(dá)到組織爆破狀態(tài)，根據(jù)睫狀體光凝時的反應(yīng)對激光能量進(jìn)行調(diào)整或者是調(diào)整探頭與睫狀突之間的距離。前后房內(nèi)注入透明質(zhì)酸鈉，11點鐘位擴(kuò)大切口，植入人工晶狀體，I/A注吸透明質(zhì)酸鈉及殘留晶狀體皮質(zhì)。

用10-0尼龍縫線對兩個角膜切口各縫合1針，前房內(nèi)注入生理鹽水形成前房，妥布霉素地塞米松眼膏(典必殊)涂眼。

1.3.2 TRAB+Phaco+IOL手術(shù) D組麻醉、散瞳、洗眼、消毒等同ECP+Phaco+IOL手術(shù)。12點鐘位沿角膜緣剪開球結(jié)膜，做以穹隆部為基底的結(jié)膜瓣，結(jié)膜瓣下做一約4 mm×5 mm大小鞏膜瓣。11點鐘位做3.2 mm的透明角膜切口，3點鐘位用15°刀做輔助角膜切口，前房內(nèi)注入透明質(zhì)酸鈉，撕囊、水分離、水分層、超聲乳化晶狀體核、I/A注吸晶狀體皮質(zhì)，前后房內(nèi)注入透明質(zhì)酸鈉，植入人工晶狀體，I/A注吸殘留晶狀體皮質(zhì)及前后房內(nèi)透明質(zhì)酸鈉。鞏膜瓣下切除約1 mm×3 mm大小的小梁組織。用10-0尼龍線縫合鞏膜瓣2針、結(jié)膜瓣4針，11點鐘位角膜切口縫合1針，前房內(nèi)注入生理鹽水形成前房。妥布霉素地塞米松眼膏(典必殊)涂眼。

4組術(shù)后嚴(yán)密觀察結(jié)膜濾過泡情況，角膜是否透明，前房深淺及是否有滲出反應(yīng)，瞳孔是否粘連，人工晶狀體位置，眼壓等情況。

1.4 房水成分檢測 分別于術(shù)前及術(shù)后1 d、7 d、14 d、30 d進(jìn)行房水成分檢測，愛爾卡因眼液表面麻醉后，在無菌條件下，一次性1 mL滅菌注射器從角膜緣行前房穿刺，每眼抽取房水 0.10～0.15 mL于－30℃中保存，主要包括蛋白質(zhì)濃度、TNF-α和 IL-1β含量檢測。

1.4.1 蛋白質(zhì)濃度檢測 紫外分光光度法:(1)吸收曲線的繪制:吸取5 g·L－1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(結(jié)晶牛血清白蛋白)2 mL于10 mL比色管中，稀釋至刻度，搖勻。在190～400 nm區(qū)間測量吸光度。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別吸取5 g·L－1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 于 5 只 10 mL比色管中，稀釋至刻度并搖勻。在280 nm處分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A280。(3)樣品測定:取房水0.10 mL，加3 mL生理鹽水稀釋，按上述方法測定280 nm處的吸光度，平行測定3份。(4)數(shù)據(jù)處理:繪制吸收曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出并計算房水中蛋白質(zhì)的濃度 C=(a1+a2+a3)×30/3。

1.4.2 TNF-α和 IL-1β含量檢測 使用雙抗體夾心酶聯(lián)的免疫吸附實驗(ABC-ELISA法)，檢測TNF-α和IL-1β含量，在450 nm處測 OD值，因為 TNF-α、IL-1β濃度與OD值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本溶液中的TNF-α、IL-1β含量。

1.5 術(shù)后觀察指標(biāo) 術(shù)前及術(shù)后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d、30 d用裂隙燈觀察角膜、前房深度、前房炎癥反應(yīng)、IOL位置。

前房炎癥反應(yīng)的分級標(biāo)準(zhǔn):前房閃輝采用半定量分級，將房水閃輝分為5個等級:0:無或可疑前房閃輝;+:微弱前房閃輝;++:中等度前房閃輝;+++:顯著前房閃輝;++++:嚴(yán)重前房閃輝并伴有大量纖維素樣滲出，虹膜與晶狀體前表面難以辨別。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，組間不同時間房水蛋白質(zhì)、TNF-α、IL-1β含量采用重復(fù)測量資料的方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義者再行Bonferroni法多重比較，組間前房反應(yīng)差異比較采用非參數(shù)檢驗，前房反應(yīng)與術(shù)后蛋白質(zhì)濃度行Spearman等級相關(guān)分析，以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 房水蛋白質(zhì)濃度、TNF-α含量、IL-1β含量不同組間房水蛋白質(zhì)濃度隨時間變化趨勢相同(F組間*時間=1.538，P=0.153);同一組內(nèi)不同時間點房水蛋白質(zhì)濃度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F時間=574.828，P ＜0.01);術(shù)后 1 d、7 d、14 d 房水中蛋白質(zhì)濃度較術(shù)前升高，術(shù)后1 d達(dá)到高峰，30 d基本恢復(fù)至術(shù)前水平(表1)。相同時間點不同組間房水蛋白質(zhì)濃度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05，見表1)。

表1 術(shù)前、術(shù)后各組不同時間房水蛋白質(zhì)濃度Table 1 Protein concentration in aqueous humor at preoperative and postoperative different time in each group (，ρ/g·L－1)

表1 術(shù)前、術(shù)后各組不同時間房水蛋白質(zhì)濃度Table 1 Protein concentration in aqueous humor at preoperative and postoperative different time in each group (，ρ/g·L－1)

Note:Compared with preoperation，aP ＜0.05;Compared with 1 day postoperative，bP＜0.05;Compared with 7 days postoperative，cP＜0.05;Compared with 14 days postoperative，dP＜0.05

Group Preoperation 1 day postoperative 7 days postoperative 14 days postoperative 30 days postoperative A 0.49±0.08 1.48±0.18a 1.44±0.19a 0.73±0.25bc 0.46±0.14bcd B 0.47±0.07 1.53±0.14a 1.34±0.14a 0.88±0.30abc 0.56±0.20bcd C 0.48±0.09 1.55±0.15a 1.48±0.13a 0.96±0.24abc 0.58±0.18bcd D 0.46±0.07 1.55±0.17a 1.40±0.10a 0.82±0.24abc 0.61±0.25bcd F 0.168 0.506 0.523 1.497 1.119 P 0.917 0.680 0.669 0.231 0.354

不同組間房水TNF-α含量隨時間變化趨勢相同(F組間*時間=0.776，P=0.593);同一組內(nèi)不同時間點房水TNF-α含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F時間=982.576，P ＜0.01);術(shù)后 1 d、7 d、14 d 房水中 TNF-α濃度升高，術(shù)后7 d達(dá)到高峰，30 d基本恢復(fù)至術(shù)前水平(表2)。相同時間點不同組間房水TNF-α含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為 P＞0.05，見表2)。

表2 術(shù)前、術(shù)后不同時間房水TNF-α含量Table 2 Levels of TNF-α in aqueous humor at preoperative and postoperative different time in each group(ˉx± s，ρ/pg·mL－1)

不同組間房水IL-1β含量隨時間變化趨勢相同(F組間*時間=1.412，P=0.203);同一組內(nèi)不同時間點房水IL-1β含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F時間=689.178，P ＜0.01);術(shù)后 1 d、7 d、14 d 房水中 IL-1β濃度升高，術(shù)后14 d達(dá)到高峰，30 d基本恢復(fù)至術(shù)前水平(表3)。相同時間點不同組間房水IL-1β含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05，見表3)。2.2 術(shù)后前房炎癥反應(yīng)及并發(fā)癥 術(shù)后1 d、7 d、14 d大部分出現(xiàn)+～++的前房反應(yīng)，B組、C組、D組各出現(xiàn)1眼++++的前房纖維素樣滲出反應(yīng);30 d后大部分為0～+前房反應(yīng)，D組仍有1眼為+++前房纖維素樣滲出反應(yīng);術(shù)后房水蛋白質(zhì)濃度與前房炎癥反應(yīng)相關(guān)分析:4組術(shù)后蛋白質(zhì)濃度與術(shù)后前房炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)(均為P＜0.05)。

術(shù)后1個月，A組有2眼，B組、D組各有1眼眼壓偏高，C組有3眼、D組1眼眼壓偏低。術(shù)中、術(shù)后各組均未出現(xiàn)爆發(fā)性脈絡(luò)膜出血、人工晶狀體脫位、視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜脫離、眼內(nèi)炎等嚴(yán)重并發(fā)癥。

表3 術(shù)前、術(shù)后各組不同時間房水IL-1β含量Table 3 Levels of IL-1β in aqueous humor at preoperative and postoperative different time in each group(ˉx± s，ρ/pg·mL－1)

3 討論

青光眼合并白內(nèi)障患者以往主要有3種手術(shù)方式:包括分期手術(shù)(先行抗青光眼手術(shù)后再行白內(nèi)障手術(shù))、聯(lián)合手術(shù)、單純白內(nèi)障手術(shù)。而目前聯(lián)合手術(shù)主要是TRAB+Phaco+IOL手術(shù)，但是這種聯(lián)合手術(shù)同樣存在諸多問題及可能出現(xiàn)的并發(fā)癥。Lima等［8］對368眼行ECP+Phaco手術(shù)，術(shù)后2 a發(fā)現(xiàn)眼壓平均減少47.4%，藥物數(shù)量從(1.44±0.97)種減少至(0.37±0.74)種。Lindfield 等［9］對 58 眼ECP+Phaco手術(shù)的結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)在沒有用降眼壓藥物下，眼壓降低32.9%。普遍認(rèn)為 ECP+Phaco+IOL手術(shù)可以作為治療合并白內(nèi)障和青光眼的主要手段之一。

血-房水屏障包括睫狀上皮細(xì)胞間、基底細(xì)胞膜以及虹膜血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，可限制大分子物質(zhì)進(jìn)入房水內(nèi)，因此房水中蛋白質(zhì)含量極少，房水蛋白質(zhì)含量是判定血-房水屏障有無破壞的重要指標(biāo)。青光眼、白內(nèi)障手術(shù)均可引起房水蛋白質(zhì)含量升高，Pande等［10］認(rèn)為白內(nèi)障摘出手術(shù)后引起后發(fā)性白內(nèi)障的晶狀體上皮細(xì)胞增殖可能與血-房水屏障功能的破壞有關(guān)。喬利亞等［11］報道了青光眼小梁切除術(shù)后第2天血-房水屏障破壞，而在術(shù)后1周左右恢復(fù)到術(shù)前水平，認(rèn)為手術(shù)對血-房水屏障破壞是短時間的。羅莉霞等［12］報道 Phaco+IOL術(shù)后1 d、7 d、14 d術(shù)眼房水蛋白質(zhì)濃度均高于術(shù)前，而術(shù)后30 d與術(shù)前基本相同。

本研究發(fā)現(xiàn)A組、B組、C組、D組術(shù)后均出現(xiàn)蛋白質(zhì)濃度升高，1 d達(dá)到最高峰，以后逐漸下降，30 d基本達(dá)到術(shù)前水平，但是各組間無明顯差異，表明睫狀體光凝范圍不同對前房內(nèi)蛋白質(zhì)的滲出無影響。Wang等［13］認(rèn)為小梁網(wǎng)激光光凝升高眼壓可以導(dǎo)致血-房水屏障破壞。本研究也發(fā)現(xiàn)術(shù)前慢性高眼壓狀態(tài)下房水蛋白質(zhì)濃度、TNF-α和IL-1β含量均有所升高。

細(xì)胞因子目前已發(fā)現(xiàn)十多族共50多種，包括TNF和IL等，細(xì)胞因子是一類多功能、強(qiáng)效的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，對炎性和免疫反應(yīng)具有重要調(diào)節(jié)作用［14］。TNF-α與IL-1β可能參與炎癥反應(yīng)的不同過程。周朝暉等［15］研究表明，人晶狀體上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生了 IL-1、IL-6等因子，在白內(nèi)障術(shù)后的兔眼中也發(fā)現(xiàn)存在 IL-1和 IL-6。祁明信等［16］研究表明人工晶狀體植入術(shù)后1～2周，前房滲出程度最嚴(yán)重，房水中單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)都達(dá)到高峰，房水中 TNF-α和 IL-1的含量也最高;認(rèn)為細(xì)胞因子作為炎性介質(zhì)在人工晶狀體植入術(shù)后眼內(nèi)炎性反應(yīng)中起一定的作用。Nishi等［17］研究表明IL-1顯著促進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖和膠原合成，說明IL-1除了是一種炎癥介質(zhì)外，還可能參與后發(fā)性白內(nèi)障的形成。并有研究認(rèn)為術(shù)后房水IL-1β水平與后囊混濁程度呈正相關(guān)，囊膜混濁越重，其術(shù)后7～14 d房水IL-1β的含量越高，而IL-1β含量越高，囊膜混濁重且混濁持續(xù)時間越長［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)A組、B組、C組、D組術(shù)后1 d、7 d、14 d均出現(xiàn)不同程度的前房反應(yīng);術(shù)后各組均出現(xiàn)TNF-α含量升高，至7 d達(dá)到最高峰，以后逐漸下降，30 d下降至術(shù)前水平;術(shù)后各組均出現(xiàn)IL-1β含量升高，至14 d達(dá)到最高峰，以后逐漸下降，30 d下降至術(shù)前水平。IL-1β高峰出現(xiàn)在TNF-α高峰后，可能是由于TNF-α的誘導(dǎo)及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，激活嗜中性粒細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞并刺激單核吞噬細(xì)胞合成IL-1β。有研究報告［19］，人工晶狀體植入術(shù)后房水中TNF-α的含量7～14 d達(dá)到最高，房水中 IL-1的活性術(shù)后3～14 d最高，而這些變化與房水中單核細(xì)胞增多的時間基本一致，因此認(rèn)為大量的TNF-α和IL-1產(chǎn)生是單核細(xì)胞浸潤引起的，并導(dǎo)致和加重術(shù)后眼內(nèi)炎性反應(yīng)。各組間TNF-α和IL-1含量無明顯差異，表明睫狀體光凝范圍不同對前房內(nèi)TNF-α、IL-1β含量無明顯影響，兩種聯(lián)合手術(shù)方式相比，對前房血-房水屏障的破壞、產(chǎn)生的前房炎癥反應(yīng)相似。

對于有白內(nèi)障的青光眼患者可進(jìn)行ECP+Phaco+IOL聯(lián)合手術(shù)，有手術(shù)過程快、不受濾過泡影響、具有穩(wěn)定的降壓效果、對眼球組織不產(chǎn)生新的手術(shù)創(chuàng)傷、術(shù)后視力恢復(fù)快等優(yōu)點，雖然短期內(nèi)可導(dǎo)致血-房水屏障破壞，房水中細(xì)胞因子含量增加，但均在1個月左右恢復(fù)術(shù)前水平，同時與 TRAB+Phaco+IOL術(shù)相比并未明顯增加前房炎癥反應(yīng)，是相對安全有效的新方法，目前對ECP+Phaco+IOL聯(lián)合手術(shù)的報道較少，需要深入研究探討。

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