多西環(huán)素對堿燒傷大鼠角膜組織中IL-1和TNF-α表達(dá)的影響△

付馨余 鄒文進(jìn) 喻謙 付敏 唐文婷

角膜堿燒傷是臨床上常見且嚴(yán)重的致盲性眼外傷［1］。在堿燒傷早期積極阻止炎癥因子的釋放和炎癥細(xì)胞的侵入，是提高眼前段堿燒傷治愈率，減少嚴(yán)重并發(fā)癥的關(guān)鍵［2］。多西環(huán)素是一類具有特殊的非抗菌性抗炎作用的四環(huán)素類抗生素。已有研究表明多西環(huán)素能降低炎性細(xì)胞因子的生成和活性，減少一氧化氮的生成，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的生成和活性［3］，多西環(huán)素作用于鼠哮喘模型氣道可明顯抑制炎癥細(xì)胞浸潤［4］。除強(qiáng)大的抗炎作用外，多西環(huán)素還可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［5-6］，誘導(dǎo)活化的 THP-1發(fā)生凋亡［7］。近年來多西環(huán)素在眼表疾病治療中的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注，但目前其抗炎的機(jī)制并未完全明了。本文通過大鼠角膜堿燒傷模型，研究多西環(huán)素對IL-1及TNF-α表達(dá)的影響，探討多西環(huán)素作用于角膜堿燒傷的抗炎機(jī)制及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康 SPF級 SD(Sprague Dawley)大鼠64只64眼，體質(zhì)量200～250 g，鼠齡6～8周，雌性(廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)。實(shí)驗(yàn)前通過裂隙燈檢查排除眼前節(jié)疾病，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為陰性對照組和多西環(huán)素組，每組32只32眼，兩組均按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)取一眼建立角膜堿燒傷模型，燒傷后立即給予眼液滴眼，多西環(huán)素組以3 g·L－1多西環(huán)素眼液滴眼，陰性對照組以眼液溶媒滴眼，溶媒除不含多西環(huán)素外，其余成分均與3 g·L－1多西環(huán)素眼液相同。每日4次，每次20 μL。實(shí)驗(yàn)遵循國家實(shí)驗(yàn)動物管理保護(hù)條例。

1.1.2 試劑及儀器 顯微手術(shù)器械(蘇州醫(yī)療器械廠);眼科顯微鏡(日本Olympus公司);各種規(guī)格微量移液器(美國Thermo公司);IL-1及 TNF-α ELISA試劑盒(美國 Rapid Bio Lab公司);酶標(biāo)儀(美國Thermo Labsystem);多西環(huán)素(Doxycycline，美國 Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠角膜堿燒傷模型的制備 健康SD大鼠64只，堿燒傷模型建立前1 d用5 g·L－1妥布霉素眼液點(diǎn)眼預(yù)防感染，每天4次，實(shí)驗(yàn)前通過裂隙燈檢查排除眼前節(jié)疾病。按照0.02 mL·kg－1體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射100 g·L－1水合氯醛進(jìn)行麻醉，結(jié)膜囊內(nèi)滴10 g·L－1丁卡因行表面麻醉，棉簽擦干結(jié)膜囊內(nèi)液體。自制堿燒傷模具:在200 μL容積的槍頭距尾部15 mm處水平切去槍頭前端，用刀片小心將切口端外部削薄，在槍頭內(nèi)填塞適量棉花，使槍頭切口端外露的棉花形成一個平整微凸面，松緊度適中，槍頭尾部用紙膠布封貼，高壓高溫滅菌備用。于模具內(nèi)滴入 200 μL 1 mol·L－1NaOH，將模具垂直放置大鼠一側(cè)角膜中央30 s，迅速用20 mL生理鹽水沖洗燒傷區(qū)及結(jié)膜囊1 min。沖洗完畢后可見角膜中央有一圓形灰白色燒灼斑，直徑約4 mm，堿燒傷后立即給予眼液滴眼，多西環(huán)素組以3 g·L－1多西環(huán)素眼液滴眼;陰性對照組以眼液溶媒滴眼，溶媒除不含多西環(huán)素外，其余成分均與3 g·L－1多西環(huán)素眼液相同。每天4次，每次1滴，約20 μL。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附劑試驗(yàn)(ELISA)檢測 IL-1及TNF-α蛋白含量 步驟如下:(1)角膜組織蛋白提取:于堿燒傷后第3天、第7天、第14天、第21天每組隨機(jī)選取8只大鼠，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛處死，使用無菌手術(shù)器材沿角鞏膜緣快速取下角膜標(biāo)本，剪碎后加入200 μL純水進(jìn)行組織勻漿，低溫離心機(jī)10 000 r·min－14℃離心10 min，取上清液備用。BCA法測各標(biāo)本總蛋白濃度(mg·mL－1)。(2)ELISA測定:按照試劑盒說明書小心操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光光度值(OD值)，使用專業(yè)軟件(Curve Expert1.3)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)IL-1和TNF-α的蛋白濃度(ng·mL－1)。IL-1和 TNF-α的蛋白濃度分別比上各標(biāo)本的總蛋白濃度即為單位總蛋白中 IL-1和 TNF-α 的相對表達(dá)量(μg·g－1)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用方差分析，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多西環(huán)素作用后IL-1蛋白的表達(dá) 多西環(huán)素組在第3天、第7天與陰性對照組比較IL-1蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017、0.032);第14天、第21天與陰性對照組比較IL-1蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05，見表1)。

2.2 多西環(huán)素作用后TNF-α蛋白表達(dá) 多西環(huán)素組在第3天、第7天與陰性對照組比較TNF-α蛋白表達(dá)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002、0.029);第14天、第21天與陰性對照組比較 TNF-α蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05，見表1)。

表1 堿燒傷大鼠角膜組織中IL-1和TNF-α蛋白相對表達(dá)量Table 1 Amount of IL-1 and TNF-α related protein in rat alkali burn corneas(，relative expression/μg·g－1)

表1 堿燒傷大鼠角膜組織中IL-1和TNF-α蛋白相對表達(dá)量Table 1 Amount of IL-1 and TNF-α related protein in rat alkali burn corneas(，relative expression/μg·g－1)

Time IL-1TNF-α Negative control Doxycycline Day 3 127.58±35.92 53.77±21.18 69.45±21.43 2 Negative control Doxycycline 4.06±9.39 Day 7 89.54±42.63 36.60±10.78 55.37±18.34 14.81±5.72 Day 14 38.32±10.87 15.18±3.04 39.42±16.50 14.29±5.37 Day 21 19.69±8.47 16.72±3.76 9.64±3.22 12.54±3.22

3 討論

近年來關(guān)于多西環(huán)素作用于角膜堿燒傷的研究逐漸增多，研究表明以多西環(huán)素為代表的四環(huán)素類具有抑制膠原酶活性的作用，兔角膜堿燒傷后肌肉注射鹽酸四環(huán)素能明顯減少角膜潰瘍的發(fā)生率［8］，口服多西環(huán)素(5 mg·kg－1·d－1)可減少角膜潰瘍的發(fā)生，促進(jìn)上皮生長［9］;將多西環(huán)素作用于大鼠角膜堿燒傷可以抑制新生血管的形成［10］;這表明多西環(huán)素在動物角膜堿燒傷中的抗炎作用已得到認(rèn)可，但抗炎作用的具體機(jī)制還不完全清楚。

此次我們選擇的研究對象IL-1是一種由多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有趨化作用的早期炎癥細(xì)胞因子，在角膜損傷后的炎癥反應(yīng)中扮演非常重要的角色，IL-1能調(diào)節(jié)角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶，進(jìn)一步導(dǎo)致角膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡。研究表明，多西環(huán)素能抑制關(guān)節(jié)細(xì)胞中IL-1的產(chǎn)生及活性［11］;在多西環(huán)素作用下，葡萄球菌內(nèi)毒素刺激外周血單核細(xì)胞分泌IL-1的作用受到抑制［12］，多西環(huán)素作用于體外培養(yǎng)的人結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞，能在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平同時抑制IL-1的表達(dá)，顯著下調(diào)IL-1的生物活性，同時能上調(diào)IL-1受體抗體(IL-IRA)的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)IL-1轉(zhuǎn)換酶的穩(wěn)定性，從而達(dá)到良好的抗炎效果［13-14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:堿燒傷后3 d、7 d陰性對照組 IL-1呈現(xiàn)高表達(dá)，隨后在14 d、21 d明顯降低，3 d、7 d時多西環(huán)素組 IL-1的表達(dá)較陰性對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這與多西環(huán)素能抑制IL-1基因表達(dá)的觀點(diǎn)相符，14 d、21 d雖有減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，應(yīng)該與14 d、21 d時炎癥已有消退，IL-1表達(dá)已經(jīng)回落到較低水平有關(guān)。

TNF-α是一種主要由活化的單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多能性炎癥因子，在角膜創(chuàng)傷后介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)及宿主防御機(jī)制，在角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程中起到關(guān)鍵性作用［15］。局部高濃度的 TNF-α可吸引中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞向燒傷創(chuàng)面組織浸潤，進(jìn)一步增加了炎癥細(xì)胞因子的水平，加重炎癥反應(yīng)，且有可能啟動中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的血栓形成，引起角膜組織進(jìn)行性壞死，導(dǎo)致角膜潰瘍。研究表明，在小鼠角膜堿燒傷后早期階段，角膜基質(zhì)細(xì)胞中TNF-α轉(zhuǎn)化酶及TNF受體1的表達(dá)有明顯上調(diào)［16-17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，堿燒傷后3 d、7 d陰性對照組TNF-α呈現(xiàn)高表達(dá)，隨后在14 d降低，21 d時明顯降低，3 d、7 d時多西環(huán)素組TNF-α的表達(dá)較陰性對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，14 d、21 d差異無統(tǒng)計學(xué)意義，符合多西環(huán)素能下調(diào)TNF-α基因表達(dá)的觀點(diǎn)。

綜合以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出結(jié)論，在大鼠角膜堿燒傷早期炎癥反應(yīng)過程中，多西環(huán)素能下調(diào)IL-1、TNF-α基因的表達(dá)，IL-1、TNF-α表達(dá)的變化說明了IL-1、TNF-α在角膜堿燒傷早期炎癥反應(yīng)中起重要作用。

多西環(huán)素作用于角膜堿燒傷的抗炎機(jī)制現(xiàn)在并未完全明了，研究表明，多西環(huán)素可促進(jìn)角膜堿燒傷炎癥細(xì)胞凋亡［18］，并且與核因子 NF-κB及其他炎癥因子有關(guān)，而核因子NF-κB本身便可參與IL-1的表達(dá)，究竟多西環(huán)素對IL-1及TNF-α表達(dá)的影響是直接抑制其活化還是通過NF-κB途徑抑制，究竟抑制作用是否還有其他因子的參與都值得進(jìn)一步研究。

總之，本研究初步顯示了多西環(huán)素能抑制堿燒傷大鼠角膜中IL-1及TNF-α的表達(dá)，進(jìn)一步減輕炎癥反應(yīng)。這很可能是多西環(huán)素抑制角膜堿燒傷炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一，這為我們研究多西環(huán)素在大鼠堿燒傷中的應(yīng)用提供了一定的依據(jù)和基礎(chǔ)。

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