淚腺腫瘤組織中GPX3基因mRNA和蛋白的表達(dá)及其相關(guān)性

趙凱

淚腺腫瘤是眼眶較為常見的腫瘤之一。淚腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多種基因功能的改變密切相關(guān)，是一個復(fù)雜的多步驟的過程，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活［1-3］。谷胱甘肽過氧化物酶3(glutathione peroxidase 3，GPX3)是GPXs家族中的成員之一，是近年來發(fā)現(xiàn)的具有抑癌作用的基因［4］。在人類的許多惡性腫瘤中低表達(dá)，而在淚腺腫瘤組織中，GPX3基因mRNA和蛋白的表達(dá)及其相關(guān)性的有關(guān)報道尚少［5-8］。本研究分別從mRNA及蛋白水平檢測GPX3基因在32例淚腺多形性腺瘤、28例淚腺腺樣囊性癌及9例正常淚腺組織中的表達(dá)，并探討其表達(dá)和淚腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究隨機(jī)選取2011年1月至2014年2月鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院眼科手術(shù)標(biāo)本。根據(jù)患者的病理組織學(xué)檢查結(jié)果，將所取標(biāo)本進(jìn)行分組。淚腺良性腫瘤組患者的標(biāo)本32例，為淚腺多形性腺瘤;淚腺惡性腫瘤組患者的標(biāo)本28例，為淚腺腺樣囊性癌;開放性眼眶損傷患者所切除的損傷部位淚腺共9例，為正常淚腺組織組。其中男33例，女36例，年齡21～77歲，中位年齡 49歲。所有病例術(shù)前均未接受化學(xué)治療、放射治療。所取標(biāo)本即刻用液氮凍存并在－80℃條件下保存。

1.2 主要試劑 RNA試劑及RT-PCR反應(yīng)試劑盒購自大連TakaRa生物技術(shù)公司?？笹PX3兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。鼠抗人內(nèi)參β-actin一抗購自北京康為世紀(jì)公司。

1.3 RT-PCR檢測 GPX3的 mRNA表達(dá) 取50 mg組織應(yīng)用 Trizol法提取組織中的 RNA，經(jīng) Nanodrop分光光度計(jì)檢測其純度和濃度。取 2 μg總RNA，按照試劑盒說明逆轉(zhuǎn)合成 cDNA。然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系:cDNA 1 μL，PCR 混合物 9.5 μL，上下游引物各 1 μL，雙蒸水補(bǔ)至 25 μL。GPX3引物序列:上游 5’-TAGGGAGCCCTCACCATTGAT-3’，下游 5’-CTGAGTTCACTCCTGGTTCCT-3。β-actin引物序列:上游 5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下游5’-TAAAGACCTCTATGCCAGT-3’。循環(huán)參數(shù):94℃ 4 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72 ℃1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 終延伸 7 min。取PCR 產(chǎn)物5 μL，20 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。用去離子水作陰性對照。使用Quantity-one軟件，計(jì)算各個樣本GPX3表達(dá)水平，表達(dá)量的相對值=待測基因擴(kuò)增條帶的灰度值/β-actin基因擴(kuò)增條帶的灰度值。

1.4 Western blot檢測 GPX3的蛋白表達(dá) 取30 μg組織總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳80 V，待蛋白至分離膠后120 V。濕轉(zhuǎn)220 mA，2 h后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。50 g·L－1脫脂奶粉封閉1 h。加入1∶1000的1×TBS稀釋的一抗GPX3，4℃過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶3000的1×TBS稀釋的二抗，室溫1 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶1000的1×TBS稀釋的鼠抗人內(nèi)參β-actin一抗，4℃過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶3000的1×TBS稀釋的二抗，室溫1 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min。待暗室加入ECL發(fā)光劑曝光，顯影。使用Quantity-one軟件計(jì)算各個樣本GPX3蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)資料，組間比較采用Fisher’s精確檢驗(yàn)法;GPX3在不同性別、年齡、腫瘤大小淚腺上皮性腫瘤中的表達(dá)差異采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常淚腺組織與良、惡性淚腺腫瘤組織中GPX3 mRNA的表達(dá) 淚腺組織正常組、淚腺多形性腺瘤及淚腺腺樣囊性癌中的GPX3 mRNA表達(dá)量分別為 0.90±0.01、0.48±0.03 和 0.21±0.01(表1)，正常淚腺組織和淚腺多形性腺瘤及淚腺腺樣囊性癌的GPX3 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);淚腺多形性腺瘤及淚腺腺樣囊性癌中GPX3 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);GPX3 mRNA表達(dá)量在正常淚腺組織中明顯高于淚腺多形性腺瘤(P＜0.05，見圖1);正常淚腺組織與淚腺腺樣囊性癌相比，其GPX3 mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表1 正常淚腺組織、淚腺多形性腺瘤和淚腺腺樣囊性癌中GPX3 mRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)果Table 1 Expression of GPX3 mRNA in normal，benign and malignant neoplasms of lacrimal gland

Figure 1 Expression level of GPX3 mRNA in normal，benign and malignant neoplasms of lacrimal gland by RT-PCR.Ne:Negative control;N:Normal neoplasms of lacrimal gland;T:Benign neoplasms of lacrimal gland;C:Malignant neoplasms of lacrimal gland RT-PCR分析GPX3 mRNA在正常淚腺組織、淚腺多形性腺瘤和淚腺腺樣囊性癌中的表達(dá)。Ne:陰性對照;N:正常淚腺組織;T:淚腺多形性腺瘤;C:淚腺腺樣囊性癌

2.2 正常淚腺組織與良、惡性淚腺腫瘤組織中GPX3蛋白的表達(dá) 正常淚腺組織、淚腺多形性腺瘤及淚腺腺樣囊性癌中的GPX3蛋白表達(dá)量分別為1985.00±121.63、768.01±121.32、0(表2)。正常淚腺組織和淚腺多形性腺瘤及淚腺腺樣囊性癌的GPX3蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);淚腺多形性腺瘤及淚腺腺樣囊性癌中GPX3蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);GPX3蛋白表達(dá)量在正常淚腺組織中明顯高于淚腺多形性腺瘤(P＜0.05，見圖2);正常淚腺組織與淚腺腺樣囊性癌相比，GPX3蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 淚腺正常組織、淚腺多形性腺瘤和淚腺腺樣囊性癌中GPX3蛋白表達(dá)結(jié)果Table 2 Expression of GPX3 protein in normal，benign and malignant neoplasms of lacrimal gland

2.3 GPX3 mRNA和蛋白的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系 如表3所示:GPX3 mRNA在淚腺腺樣囊性癌中的表達(dá)與患者的年齡、性別及腫瘤大小無關(guān)，其mRNA的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。如表4所示:GPX3蛋白的表達(dá)與其臨床病理特征分析顯示，與患者的年齡、性別、腫瘤大小差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。

Figure 2 Expression level of GPX3 protein in normal，benign and malignant neoplasms of lacrimal gland by RT-PCR.N:Normal neoplasms of lacrimal gland;T:Benign neoplasms of lacrimal gland;C:Malignant neoplasms of lacrimal gland Western blot印記分析GPX3蛋白在正常淚腺組織、淚腺多形性腺瘤和淚腺腺樣囊性癌中的表達(dá)。N:正常淚腺組織;T:淚腺多形性腺瘤;C:淚腺腺樣囊性癌

表3 GPX3 mRNA與淚腺腺樣囊性癌臨床病理特征的關(guān)系Table 3 Relationship between GPX3 mRNA expression and clinical features in malignant neoplasms of lacrimal gland

表4 GPX3蛋白與淚腺腺樣囊性癌臨床病理特征的關(guān)系Table 4 Relationship between GPX3 protein expression and clinical features in malignant neoplasms of lacrimal gland

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡變是多因素、多階段、多步驟和多基因改變的過程［9-10］。淚腺上皮性腫瘤是眼眶內(nèi)常見腫瘤之一，它包括一類組織成分多樣性、腫瘤異質(zhì)性明顯的淚腺腫物［11］。其中良性腫瘤易復(fù)發(fā)和惡變，惡性腫瘤復(fù)發(fā)及死亡率較高。因此，從分子生物學(xué)水平揭示淚腺良惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制，研究其生物學(xué)指標(biāo)具有重要的意義。癌細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的活性氧簇并起到抑制凋亡的作用，并且過氧化氫有輔助增殖、侵襲、遷移及促進(jìn)血管形成的作用。細(xì)胞的命運(yùn)有賴于體內(nèi)活性氧簇的平衡。與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞具有兩大特點(diǎn)，活性氧簇的產(chǎn)量增加和活性氧的清除能力下降。很多相關(guān)的酶，如超氧化物歧化酶、GPX和一些抗氧化物的過氧化氫酶以及能夠中和活性氧簇的酶類作用下降［12-13］。

GPX3是GPX家族中的成員之一，主要由腎臟的近端小管合成，是一種具有典型前導(dǎo)序列的胞外酶。該基因位于5q23，是一個在腫瘤中常見的染色體雜合性缺失位點(diǎn)［4］。GPX3是一種氧自由基代謝酶，它在正常組織中是高表達(dá)的，被認(rèn)為具有抑癌基因的活性。GPX3在胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)顯著下降［4-5，7-8］。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RT-PCR及Western blot檢測32例淚腺多形性腺瘤、28例淚腺腺樣囊性癌及9例正常淚腺組織中GPX3的mRNA及蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，良、惡性淚腺腫瘤組織GPX3 mRNA在基因轉(zhuǎn)錄水平上均低于淚腺正常組織(均為P＜0.05)，提示淚腺組織中GPX3的轉(zhuǎn)錄水平的降低和失活與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)而我們通過蛋白水平研究發(fā)現(xiàn)，淚腺惡性腫瘤組織中GPX3蛋白的表達(dá)低于淚腺良性腫瘤組織(P＜0.05)，說明GPX3基因的低表達(dá)或者缺失可能是正常淚腺組織及淚腺良性腫瘤組織惡變的機(jī)制之一，其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)和蛋白表達(dá)降低與淚腺組織惡性轉(zhuǎn)化有一定的關(guān)系。并且GPX3的表達(dá)與年齡、性別和腫瘤大小無關(guān)。

GPX3蛋白表達(dá)降低參與了惡性淚腺組織的發(fā)生和發(fā)展，檢測GPX3蛋白的表達(dá)有助于淚腺腫瘤的篩查、早期臨床診斷和判斷預(yù)后。

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