納米銀的制備及其對變異鏈球菌抗菌性的研究

李長娥，于丹妮，韓育植，李 娜

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科，天津300211）

變異鏈球菌（Streptococcusmutans,簡稱變鏈菌）是公認(rèn)的致齲菌，氟化物是有效的防齲劑，近幾年隨著其廣泛高濃度的應(yīng)用，變鏈菌耐氟株不斷出現(xiàn)[1]，這使氟化物防齲效果降低。但齲病的患病率仍然較高，故臨床上需要開發(fā)新型有效的防齲藥物。納米銀是一種新型非抗生素類抗菌劑，目前尚無細(xì)菌對其耐藥，具有量子效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和較大的比表面積等特性，呈現(xiàn)出獨特的、優(yōu)于普通材料的生物相容性及抗菌性等性能。納米銀的制備方法有多種，主要分為物理法、化學(xué)法和生物還原法，其中液相化學(xué)還原法因操作方便、設(shè)備簡單等特點而成為最常用的方法。國內(nèi)外有對納米銀的制備及其抗菌性等方面的報道[2-3]，但在葡萄糖制備的納米銀對口腔細(xì)菌抗菌性的研究還相對較少。本研究采用室溫下葡萄糖還原硝酸銀的液相化學(xué)還原法制備納米銀，并測定了該納米銀對變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株及耐氟株的抑菌圈直徑、最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）、最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的大小，初步探討了其對實驗菌的抗菌性，為新型防齲藥物的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 變異鏈球菌Ingbritt C（血清C型）國際標(biāo)準(zhǔn)株（以下稱標(biāo)準(zhǔn)株）購自四川大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所；變異鏈球菌耐氟株（以下稱耐氟株）本課題組成功構(gòu)建并保存[4]。

1.1.2 主要試劑 TPY 培養(yǎng)基（OXOID，英國）；硝酸銀、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氫氧化鈉（NaOH）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等均為分析純（天津化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 磁力攪拌器（DF－…，上海）；高速離心機（Sigma，美國）；微量加樣器（Eppendorf，德國）；紫外分光光度計（BECKMAN，美國）；標(biāo)準(zhǔn)96孔微量板（Costor，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 從-70℃冰箱中將變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株及耐氟株取出，常規(guī)復(fù)蘇，分別接種于TPY固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧（80%N2，10%H2，10%CO2）培養(yǎng)48 h，經(jīng)涂片和生化鑒定為純菌后，分別挑取單個菌落轉(zhuǎn)種于TPY液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后4 000 r/min離心10 min，棄上清，用生理鹽水將細(xì)菌沉淀物調(diào)節(jié)為0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?.5×108CFU/mL）的菌懸液備用。

1.2.2 納米銀的制備 a液：將0.51 g硝酸銀溶解于10mL蒸餾水中；b液：將1.08 g葡萄糖、0.75 g PVP、0.192 g NaOH、1.02 g CTAB放入燒瓶中，加入30mL蒸餾水，攪拌使其完全溶解。室溫下，將a液迅速加到b液中，溶液立即變?yōu)榧t棕色，即納米銀溶膠（簡稱溶膠）生成，繼續(xù)攪拌30min。將該溶膠12 000 r/min離心10min，棄上清，并用蒸餾水進(jìn)行震蕩沖洗，如此重復(fù)3次。然后高溫烘干得到納米銀粉末，經(jīng)預(yù)實驗證實該納米銀在較低濃度下抗菌性較好，用蒸餾水配制800μg/mL的溶膠作為實驗藥品，置暗處4℃下存放。用紫外-可見分光光度法（ultr aviolet-visible，UV-vis）、X 線 衍 射 （X －ray diffraction，XRD）、透射電子顯微鏡（transmission electronmicroscopy，TEM）對該納米銀進(jìn)行表征。

1.2.3 抑菌環(huán)實驗 將直徑為10mm的標(biāo)準(zhǔn)定性濾紙片高壓滅菌后，保存?zhèn)溆谩Ｔ诔瑑襞_內(nèi)，用無菌棉棒蘸取稀釋為106CFU/mL的菌液，均勻涂抹在TPY平板上，分別制備兩菌平板，置室溫干燥5 min。分別將30μL納米銀溶膠（800μg/mL）、蒸餾水滴到兩濾紙片（即1號、2號）上為實驗、對照紙片，一式2份，并晾干、紫外照射30min。在兩菌平板上，分別放上兩種紙片。將平板倒置、放于37℃恒溫箱厭氧培養(yǎng)24 h。觀察結(jié)果，并測量抑菌環(huán)直徑，測3次取平均值，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 MIC、MBC的測定 將800μg/mL的溶膠用TPY 液體培養(yǎng)基二倍稀成 400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78μg/mL 的系列濃度。取兩塊96孔板，在每一板內(nèi)分別向第一行的1到10孔內(nèi)依次加入100μL上述銀溶膠。然后吸取100μL稀釋為106CFU/mL的兩菌液分別加到兩板的以上各孔內(nèi)并混勻。11號孔為陽性對照僅加入200μL菌液，12號孔為陰性對照加入800μg/mL的溶膠200μL。一式3份，實驗重復(fù)3次。密封孔板，置于37℃溫箱厭氧培養(yǎng)24 h，觀察各孔的混濁度。在96孔板中，當(dāng)陽性對照呈現(xiàn)混濁（有菌生長），陰性對照澄清（無菌生長）時，實驗組中未見混濁孔的最低納米銀濃度即為該溶膠對實驗菌的MIC。MBC值的測定：從未混濁的實驗孔里分別取100μL液體，滴到TPY固體培養(yǎng)基上，涂布均勻，37℃溫箱厭氧生長24 h，板中未見菌生長或菌落數(shù)小于5個的藥液最低濃度視為MBC值。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 納米銀對標(biāo)準(zhǔn)株及耐氟株的抑菌圈直徑、MIC、MBC值分別以x±s表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計包軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 納米銀的表征 室溫下，葡萄糖還原硝酸銀制備出的納米銀為：均一、粒徑小、分散性高、多結(jié)晶的類球形銀粒子。如圖1，納米銀的UV-vis圖顯示銀粒子最大等離子吸收峰在411 nm處，單峰、左右對稱、半峰寬較窄（在300～500 nm內(nèi)）。將納米銀溶膠置于暗處4℃下，存放1個月，穩(wěn)定性較好；如圖2，納米銀的XRD圖中出現(xiàn)表征銀的4個明顯峰值，對應(yīng)的晶面指數(shù)由里到外依次為（111）、（200）、（220）、（311），即該納米銀為較高純度的銀納米粒子，且為多晶結(jié)構(gòu)；如圖3，TEM圖表明納米銀為分散性較好、均粒徑約為13.04 nm的類球形粒子。

圖1 納米銀的UV-vis圖Fig 1 UV-visspectrum of silver nanoparticles

圖2 納米銀的XRD圖Fig 2 XRD of silver nanoparticles

圖3 納米銀的TEM圖Fig 3 TEM of silver nanoparticles

2.2 抑菌環(huán)結(jié)果 納米銀溶膠對標(biāo)準(zhǔn)株及耐氟株的抑菌環(huán)清晰效果較好（圖4），抑菌環(huán)直徑分別為（10.87±0.67）mm、（9.68±0.86）mm,對照組無顯著抑菌性，抑菌環(huán)直徑為（0.25±0.12）mm，（0.26±0.11）mm。經(jīng)方差分析可知：與對照組相比，納米銀溶膠對標(biāo)準(zhǔn)株、耐氟株有較高的抑菌效果，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；但溶膠對標(biāo)準(zhǔn)株、耐氟株的抑菌性無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

圖4 納米銀溶膠對標(biāo)準(zhǔn)株及耐氟株的抑菌圈圖Fig 4 Thezonesof inhibition of silver colloidsagainst two strains

2.3 MIC、MBC值 納米銀溶膠對標(biāo)準(zhǔn)株及耐氟株的 MIC 分別為（2.08±0.90）μg/mL、（2.60±0.90）μg/mL，MBC 分別為 （4.16±1.81）μg/mL、（5.21±1.81）μg/mL。溶膠對標(biāo)準(zhǔn)株、耐氟株有較高的抑菌殺菌效果，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；但溶膠對標(biāo)準(zhǔn)株、耐氟株的抗菌性無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

與對照組相比，葡萄糖制備的納米銀對標(biāo)準(zhǔn)株及耐氟株均有抗菌性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；對標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌環(huán)直徑大于耐氟株，MIC、MBC值低于耐氟株，但對兩菌的抗菌效果無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

3 討論

變鏈菌是最重要的致齲菌，它在唾液中的正常量約為1×105CFU/mL[5]，實驗中將菌液濃度調(diào)為105～106CFU/mL，接近人體口腔中正常的變鏈菌量，使實驗結(jié)果有指導(dǎo)意義。氟化物有公認(rèn)的防齲效果，但隨著氟化物大量廣泛的應(yīng)用，耐氟株（可降低氟化物的抑菌性）不斷出現(xiàn)。因此，臨床上需要研發(fā)新型有效的防齲藥物，同時還應(yīng)避免耐藥株的出現(xiàn)。納米銀是以納米技術(shù)為基礎(chǔ)研制出的一種新型非抗生素類抗菌劑，不易產(chǎn)生耐藥性，且廣譜高效、安全性高，有傳統(tǒng)無機抗菌劑無法比擬的作用效果。液相化學(xué)還原法是制備納米銀最常用的方法，它是在液相有保護(hù)劑存在下，將銀鹽中的銀離子還原成銀原子，制備出納米銀粒子的方法。納米銀粒子的粒徑與其抗菌性有關(guān)，粒徑越小則抗菌性越高[6]，通過合成方法和反應(yīng)條件可對其進(jìn)行調(diào)控。最近，有納米銀抑制牙釉質(zhì)表面變鏈菌粘附性的研究[7]，也表明小粒徑納米銀有較高的抗菌性。

本研究中還原劑葡萄糖，綠色、價廉、易得；保護(hù)劑PVP，可阻止所形成的銀粒子發(fā)生團(tuán)聚，且在一定程度上可起到還原銀離子的作用；反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。通過UV-vis分光光度、XRD及TEM 3種最常用的表征手段[8-9]，對納米銀的結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了表征：制備的納米銀為分散均勻、均粒徑約為13.04 nm類球形的顆粒。UV-vis圖可表征納米銀粒子的形貌，球形表現(xiàn)為單峰，半峰寬越窄則粒徑分布越均勻。XRD是鑒定物質(zhì)晶相的有效手段，XRD圖中出現(xiàn)代表銀粒子的4個明顯峰值，說明納米銀晶體有4個晶面，對應(yīng)的晶面指數(shù)從里向外依次為（111）、（200）、（220）、（311），即該納米銀為多晶結(jié)構(gòu)。TEM可以研究納米銀的結(jié)晶情況，觀察納米粒子的形貌、分散情況，測量和評估粒子的粒徑，能準(zhǔn)確、直觀地測出納米銀的形態(tài)（如球形等形狀）等。

金屬銀和銀離子有較好的抗菌性。銀離子的抗菌性主要是借靜電吸引力與帶負(fù)電的細(xì)菌結(jié)合來實現(xiàn)的[10]：它可干擾肽聚糖的合成、破壞細(xì)胞壁，損傷細(xì)胞的功能系統(tǒng)，與細(xì)菌蛋白質(zhì)、DNA反應(yīng)而抑制細(xì)胞的生長與繁殖，從而達(dá)到抑菌殺菌的效果。另外，細(xì)菌死亡后銀離子可從細(xì)胞內(nèi)游離出來，可重復(fù)殺菌。但是納米銀的抗菌機制目前尚未完全清楚，它是一種細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)、外同時作用的復(fù)雜機制。納米銀的抗菌性與表面接觸相關(guān)，能抑制呼吸鏈的酶系統(tǒng)及改變DNA的合成等[11]。它可抑制微生物的生長，穿過細(xì)菌細(xì)胞壁破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)合，且不同類型細(xì)菌的細(xì)胞壁差異較大，抑菌效果不同：納米銀對革蘭陽性菌的抗菌性低于革蘭陰性菌的[12]。納米銀可在細(xì)胞壁上產(chǎn)生小孔，進(jìn)入周質(zhì)空間，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)使其滲透性發(fā)生變化；進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，使DNA濃縮，并與破損細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)結(jié)合積聚，最終引起胞內(nèi)物質(zhì)流失使細(xì)菌死亡[13]。此外，納米銀在液體環(huán)境中容易釋放銀離子，這將使其抗菌性進(jìn)一步增強。

隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，納米狀態(tài)下銀的殺菌能力得到提高，少量的納米銀即可產(chǎn)生較強的殺菌效果。Juan等[11]研究表明納米銀對變鏈菌的抗菌性（MIC 為 4.86μg/mL±2.71μg/mL，MBC 為 6.25 μg/mL）高于納米金、氧化鋅。本研究中，納米銀對兩實驗菌均有較高的抗菌性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。抑菌環(huán)直徑、MIC、MBC是表征藥物抗菌性最常用的指標(biāo)：同等條件下，抑菌環(huán)直徑越大，MIC、MBC值越小，藥物的抗菌性越高。標(biāo)準(zhǔn)株和耐氟株均為革蘭陽性菌對溶膠的敏感性相似，溶膠對兩菌株的抗菌性無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。該納米銀表現(xiàn)出較高抗實驗菌的性能，少量、低濃度的納米銀溶膠可產(chǎn)生較好的抗菌效果。在臨床應(yīng)用中可以避免牙齒著色，符合低毒美觀的要求，是用于抑制變鏈菌較理想的防齲藥物。同時，含納米銀與季銨鹽的抗菌劑對牙本質(zhì)上的變鏈菌也有較好的抗菌效果，將來可以溶于牙科粘結(jié)劑、密封劑及復(fù)合材料等達(dá)到抗菌作用[14]。此外，納米銀與多種抗生素可產(chǎn)生協(xié)同殺菌作用[15]，能增強原藥物的殺菌效果，可用于耐藥菌的防治。

本實驗中，室溫下葡萄糖還原硝酸銀可制備出均一、分散性好、均粒徑約為13.04 nm的類球形納米銀粒子，抗菌性能測試表明該納米銀對變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株及耐氟株均有較高的抗菌效果，在防齲、口腔抗菌材料領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。今后尚需對納米銀的制備方法、抗菌機制及在口腔環(huán)境和臨床轉(zhuǎn)化實驗等方面做進(jìn)一步研究，為齲病的防治提供一定的實驗依據(jù)。

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