黑麥冬工廠化育苗關(guān)鍵技術(shù)研究

王華宇 陳乃明 何貴整 陳麗文 時(shí)群 賴崇健

摘要：基于消毒成功的黑麥冬無(wú)菌組培苗，對(duì)繼代、壯苗、生根及培養(yǎng)過(guò)程中幾個(gè)重要的技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：最佳增殖培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 4 mg/L+NAA 0.4 mg/L；最佳壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L。增殖過(guò)程中進(jìn)行小叢芽增殖，光照強(qiáng)度設(shè)定為800～1 300 lx，可以獲得較高的增殖系數(shù)和生長(zhǎng)量；在培養(yǎng)過(guò)程中制定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)組培苗進(jìn)行分級(jí)，可以節(jié)省接種材料，得到一致性較好的種苗。

關(guān)鍵詞：黑麥冬；組織培養(yǎng)；工廠化育苗

中圖分類號(hào)： S688.404+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0138-03

收稿日期：2013-06-09

基金項(xiàng)目：珍稀樹種苗木培育技術(shù)推廣項(xiàng)目（編號(hào)：桂林科字[2011]第02號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：王華宇（1981—），男，河南南陽(yáng)人，碩士，工程師，從事植物組織培養(yǎng)和園藝栽培學(xué)研究。E-mail：hywangsky@163.com。黑麥冬（Ophiopogon planiscapus cv. Arabicus）別名黑龍，為百合科沿階草屬多年常綠簇生草本植物，是近年來(lái)引進(jìn)的新品種之一。其株高15 cm左右，葉片近黑色，狹長(zhǎng)狀，長(zhǎng) 10～15 cm，形如韭菜。黑麥冬耐寒性、抗逆性強(qiáng)，是優(yōu)良的地被觀葉植物，在歐洲和北美園林應(yīng)用較多，對(duì)種苗的需求呈現(xiàn)供不應(yīng)求的局面，但在國(guó)內(nèi)目前應(yīng)用尚少。黑麥冬通常依靠分株繁殖，但由于其生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)極低，很難滿足市場(chǎng)需求。目前，關(guān)于麥冬屬植物離體快繁的研究較多[1-4]，但利用組培技術(shù)進(jìn)行黑麥冬工廠化生產(chǎn)方面的技術(shù)和工藝研究尚未見報(bào)道。本研究在黑麥冬組織培養(yǎng)再生完整植株的工作基礎(chǔ)上，開展了工廠化生產(chǎn)過(guò)程中的若干關(guān)鍵技術(shù)研究，形成了一套高效的黑麥冬組培苗擴(kuò)繁工藝，實(shí)現(xiàn)了組培苗的工廠化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1材料

以黑麥冬莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)的優(yōu)良組培苗為試驗(yàn)材料。

1.2工廠化生產(chǎn)中的若干關(guān)鍵技術(shù)研究

1.2.1培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)增殖培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基。（1） 增殖培養(yǎng)基：細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA協(xié)同使用時(shí)，其濃度比例設(shè)為10 ∶1，具體配方如下：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；MS+6-BA 2 mg/L +NAA 0.2 mg/L；MS+6-BA 3 mg/L +NAA 0.3 mg/L；MS+6-BA 4 mg/L +NAA 0.4 mg/L；MS+6-BA 4 mg/L；MS+6-BA 5 mg/L +NAA 0.5 mg/L；MS+6-BA 6 mg/L +NAA 0.6 mg/L；（2） 壯苗培養(yǎng)基：MS；MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.05 mg/L；MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.1 mg/L；MS+6-BA 2 mg/L +NAA 0.2 mg/L；MS+6-BA 3 mg/L +NAA 0.3 mg/L；（3）生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.05 mg/L；1/2MS+NAA 0.1 mg/L；1/2MS+IBA 0.1 mg/L；1/2MS+NAA 0.2 mg/L；1/2MS+NAA 0.1 mg/L +IBA 0.1 mg/L。

1.2.2培養(yǎng)條件除特別說(shuō)明外，上述培養(yǎng)基均添加3%蔗糖和0.6%瓊脂粉，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)室溫度為 （25±2） ℃，光照時(shí)間12 h/d，增殖接管光強(qiáng)為800～1 300 lx，生根階段光強(qiáng)為2 000～3 000 lx。

1.2.3切割方法對(duì)增殖的影響將增殖苗按照單芽、小叢芽（2～3芽/叢，下同）切除愈傷組織、小叢芽基部愈傷保留 2/3、小叢芽基部愈傷全保留的方式切割，觀察不同切割方法對(duì)增殖苗生長(zhǎng)的影響。

1.2.4光照強(qiáng)度對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響以散射光狀態(tài)下（約500 lx）生長(zhǎng)的增殖苗為對(duì)照，觀察不同光強(qiáng)對(duì)黑麥冬生長(zhǎng)的影響。設(shè)置光強(qiáng)為800～1 300 lx、1 500～2 000 lx、2 000～3 500 lx。

1.2.5試管苗分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制定在增殖階段，按照組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)制定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到一定規(guī)格的進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，小芽和愈傷繼續(xù)增殖培養(yǎng)；在壯苗階段，制定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到一定規(guī)格的進(jìn)行生根培養(yǎng)，小芽和愈傷繼續(xù)進(jìn)行增殖或壯苗培養(yǎng)。

2結(jié)果與分析

2.1不同激素配比對(duì)組培苗增殖的影響

挑選生長(zhǎng)健壯的叢生芽，保留基部愈傷組織2/3左右，以2～3株/叢的團(tuán)塊轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)5周觀察生長(zhǎng)情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。不同激素組合對(duì)黑麥冬的增殖率和長(zhǎng)勢(shì)影響不同（表1）。隨著6-BA濃度的增加（1～6 mg/L），增殖系數(shù)隨之增加。6-BA濃度提高3 mg/L時(shí)，增殖率可以達(dá)到100%；當(dāng)6-BA濃度達(dá)到4 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)可以達(dá)到28，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，同時(shí)添加0.4 mg/L的NAA可以促進(jìn)組培苗抽葉（圖1-A）；當(dāng)6-BA濃度提高到5 ～6 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)雖然分別達(dá)到2.8和3.1，芽點(diǎn)較多，但叢生芽有僵化、玻璃化趨勢(shì)，影響正常生長(zhǎng)。因此選用培養(yǎng)基MS+6-BA 4 mg/L+NAA 0.4 mg/L 為金葉苔草繼代增殖的最佳培養(yǎng)基。

2.2不同切割方法對(duì)組培苗增殖的影響

由表2可知，不同的切割方式對(duì)組培苗的增殖效率和生長(zhǎng)狀況影響較大。單芽的方式接種，產(chǎn)生的芽點(diǎn)少，增殖率只有83%，且生長(zhǎng)勢(shì)差，有黃葉出現(xiàn)。采用叢芽接種的方式時(shí)，全部切除愈傷后會(huì)產(chǎn)生較多新的愈傷，但芽點(diǎn)較少；全部保留愈傷組織，老化的組織變?yōu)楹诤稚璧K營(yíng)養(yǎng)吸收，影響增殖?；勘Ａ?/3愈傷組織的情況下，新生的芽點(diǎn)數(shù)量和生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。表1不同激素配比對(duì)黑麥冬組培苗增殖的影響

培養(yǎng)基（mg/L）接種數(shù)（株）增殖率（%）增殖系數(shù)芽生長(zhǎng)狀況MS+6-BA 1+NAA 0.1150941.4芽點(diǎn)少，苗細(xì)，長(zhǎng)勢(shì)弱MS+6-BA 2+NAA 0.2150981.9芽點(diǎn)較少，苗細(xì)MS+6-BA 3+NAA 0.31501002.3芽點(diǎn)較多，較粗壯MS+6-BA 4+NAA 0.41501002.8芽點(diǎn)多，苗粗壯MS+6-BA 41501002.7芽點(diǎn)多，抽葉較少M(fèi)S+6-BA 5+NAA 0.51501002.8芽點(diǎn)多，稍有玻璃化MS+6-BA 6+NAA 0.61501003.1芽點(diǎn)多，有玻璃化注：增殖率=（增殖株數(shù)/接種數(shù)）×100%；增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/出芽株數(shù)。表2、表3同。

2.3不同壯苗培養(yǎng)基對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響

選取高度2 cm以上的叢生芽接入不同的壯苗培養(yǎng)基中，每瓶接種10叢，培養(yǎng)5周時(shí)進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。如表3所示，不同的壯苗培養(yǎng)基具有不同的增殖系數(shù)，6-BA濃度的對(duì)組培苗的增殖系數(shù)和生長(zhǎng)狀況影響很大。當(dāng)不添加6-BA或濃度不高于1 mg/L時(shí)，抽出的苗較細(xì)弱，生長(zhǎng)勢(shì)較弱，愈傷組織分化較慢；當(dāng)6-BA濃度達(dá)到2 mg/L時(shí)，組培苗粗壯，芽點(diǎn)抽出較多且生長(zhǎng)勢(shì)良好（如圖1-B）；當(dāng)6-BA濃度達(dá)到 3 mg/L 時(shí)，植株矮化且愈傷化比較嚴(yán)重，不利于后期生根。綜合叢生芽的株高和長(zhǎng)勢(shì)情況，選取MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L為金葉苔草的壯苗培養(yǎng)基。通過(guò)壯苗階段，可以提高金葉苔草種苗的質(zhì)量和一致性，有利于后期生根。表3不同激素配比對(duì)黑麥冬壯苗的影響培養(yǎng)基（mg/L）接種數(shù)（株）增殖系數(shù)生長(zhǎng)狀況MS1501.1苗極細(xì)，愈傷組織抽芽慢，黃葉多MS+6-BA 0.5+NAA 0.051501.2苗細(xì)，愈傷組織抽芽慢，有黃葉MS+6-BA 1+NAA 0.11501.5苗較細(xì)，芽點(diǎn)抽出較均勻MS+6-BA 2+NAA 0.21501.8苗粗壯，芽點(diǎn)抽出均勻MS+6-BA 3+NAA 0.31502.3苗粗壯，矮化，愈傷組織多

2.4不同激素種類和濃度對(duì)試管苗生根的影響

當(dāng)壯苗培養(yǎng)5周時(shí)，選取高度3 cm以上的植株切去基部愈傷組織，轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)（圖1-C），培養(yǎng)6周后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由表4可以看出，當(dāng)選擇NAA和IBA配合使用時(shí)，黑麥冬根系發(fā)達(dá)，生根率達(dá)到93%，且試管苗長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1-D）。單獨(dú)添加NAA時(shí)，濃度從0.05 mg/L遞增至0.2 mg/L，生根率隨之增加，但濃度達(dá)到0.15 mg/L時(shí)，基部會(huì)有愈傷組織產(chǎn)生，影響根系質(zhì)量。單獨(dú)添加IBA 0.1 mg/L時(shí)，效果比較微弱，生根率只有73%。當(dāng)配合NAA使用，選用培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.1 mg/L +IBA 0.1 mg/L時(shí)，可以得到最佳的生根效果。表4不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑麥冬組培苗生根的影響

培養(yǎng)基（mg/L）接種數(shù)（株）生根系數(shù)生根率（%）根系生長(zhǎng)狀況1/2MS+NAA 0.051004.185一致性差，根較細(xì)長(zhǎng)1/2MS+NAA 0.11004.789一致性較好，根較粗壯1/2MS+IBA 0.11003.973一致性差，根細(xì)長(zhǎng)1/2MS+NAA 0.1+IBA 0.11005.193一致性好，根粗壯1/2MS+NAA 0.151005.091一致性較好，有愈傷組織1/2MS+NAA 0.21004.793有愈傷組織，根粗短注：生根率=（生根株數(shù)/接種數(shù)）×100%；生根系數(shù)=生根數(shù)量/接種株數(shù)。

2.5不同光照強(qiáng)度對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

對(duì)組培苗增殖階段進(jìn)行報(bào)紙覆蓋遮光、調(diào)整日光燈數(shù)量和功率進(jìn)行光照強(qiáng)度設(shè)置，培養(yǎng)5周后，進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。從表5中可以看出，在完全散射光條件（500 lx）下，增殖苗葉片較嫩葉色較淺；光照超過(guò)1 500 lx又不利于黑麥冬的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。選擇光照強(qiáng)度800～1 300 lx光照，12 h/d作為培養(yǎng)條件，可以實(shí)現(xiàn)試管苗的正常生長(zhǎng)，并能夠達(dá)到最大的增殖效率和較大的生長(zhǎng)量。據(jù)測(cè)算，封閉工廠化組培中水電費(fèi)約占組培成本的45%，其中主要是電費(fèi)[5]。所以降低光照強(qiáng)度對(duì)于降低生產(chǎn)成本具有重要意義。

2.6試管苗分級(jí)對(duì)工廠化生產(chǎn)的影響

在增殖和壯苗過(guò)程中，依據(jù)組培苗的高度、愈傷和芽點(diǎn)的情況進(jìn)行分級(jí)，有利于減少接種材料的浪費(fèi)、提高接種效率，從而得到一致性較好的種苗。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和操作方式如表6所示。

2.7生產(chǎn)工藝

黑麥冬工廠化生產(chǎn)工藝流程如圖2所示。

3結(jié)論與討論

黑麥冬的增殖系數(shù)相對(duì)較低，本試驗(yàn)中增殖系數(shù)達(dá)到28，與此前報(bào)道結(jié)果相符[1]。如果繼續(xù)增高6-BA濃度，增殖系數(shù)稍有提高，但組培苗會(huì)出現(xiàn)玻璃化趨勢(shì)，所以減少接種材料的浪費(fèi)，對(duì)于規(guī)?；a(chǎn)顯得尤為重要。通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)保留基部愈傷組織2/3左右，以2～3株/叢的團(tuán)塊增殖，可有效地減少材料浪費(fèi)，提高接種效率。

在組培過(guò)程中針對(duì)組培苗的不同階段，制定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)提高生產(chǎn)效率、生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)一致的種苗非常重要。在石斛的組培生產(chǎn)中，早已有類似的標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。本試驗(yàn)中針對(duì)增殖和壯苗環(huán)節(jié)制定了篩選標(biāo)準(zhǔn)，有利于優(yōu)化生產(chǎn)流程、合理使用接種材料。若在后期生根環(huán)節(jié)進(jìn)行種苗規(guī)格分級(jí)，可得到一致性較好的移栽苗，便于進(jìn)行管理和出售。

在上述研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了黑麥冬種苗的規(guī)模化生產(chǎn)，生產(chǎn)出種性一致的種苗20余萬(wàn)株，為進(jìn)一步推廣黑麥冬的應(yīng)用奠定了種源基礎(chǔ)。目前黑麥冬組培苗以外銷居多，國(guó)內(nèi)園林應(yīng)用尚為稀少，但黑麥冬以其特殊的葉色及其良好的適應(yīng)性，有望成為我國(guó)廣大地區(qū)的優(yōu)良地被植物。

致謝：本研究中的試驗(yàn)材料和技術(shù)方法得到了上海師范大學(xué)鄭志仁博士的大力幫助，在此表示衷心感謝！

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