酸性染料比色法測定斜脈暗羅莖、葉和皮中總生物堿含量

劉冰晶　曾靖　李超　杜兵　曾發(fā)揮　曾雪亮

摘要：以小檗堿為對照品，在pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，以溴甲酚綠指示液為顯色劑，利用分光光度法在628 nm測定斜脈暗羅中總生物堿含量，結(jié)果表明，小檗堿對照品在2.0～12.0 mg/L范圍內(nèi)濃度（C）與吸光度（D）呈線性關(guān)系，回歸方程為D=0.008 2C+0.167 1，r=0.9991；斜脈暗羅莖、葉和皮中的總生物堿含量分別為 0.267 1%、1.473 7%和0.790 8%。分光光度比色法測定總生物堿含量操作簡便，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，可用于斜脈暗羅總生物堿含量的測定。

關(guān)鍵詞：斜脈暗羅；總生物堿；紫外分光光度法；莖；葉；皮

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0263-02

收稿日期：2013-05-23

基金項目：江西省教育廳項目（編號：GJJ13678）；贛南醫(yī)學(xué)院項目（編號：YB201218）。

作者簡介：劉冰晶（1988—），男，云南昆明人，碩士，助教，從事中藥化學(xué)研究。E-mail：974141690@qq.com。斜脈暗羅（Polyalthia plagioneura）屬番荔枝科（Annonaceae）暗羅屬（Polyalthia genus），系我國特有種，分布于云南、廣東、廣西南部及海南[1]，為海南優(yōu)勢種[2]。國內(nèi)外學(xué)者從暗羅屬20多種植物中得到了生物堿、萜類等多種類型化合物[3-4]，從斜脈暗羅中分離得到生物堿類化合物marcanine A和少量其他化合物[5-7]，但有關(guān)斜脈暗羅總生物堿含量的測定未見報道。本研究以小檗堿為對照品，在pH值為4.5的醋酸—醋酸鈉緩沖溶液中，以溴甲酚綠為顯色劑，在628 nm波長下，利用分光光度法測定斜脈暗羅總生物堿含量，為保護(hù)和合理利用藥用植物資源斜脈暗羅提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器、試劑與材料

紫外可見分光光度計（尤尼柯UV-4802）；98-C-數(shù)顯控溫電熱套（天津泰斯特）；索式提取器；電子天平；三氯甲烷（AR）；溴甲酚綠（AR）；小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（成都領(lǐng)航者生物）；pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液；0.01 mol/L氫氧化鈉溶液（用乙醇溶解）。

斜脈暗羅采自海南省昌江縣霸王嶺自然保護(hù)區(qū)，由海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯教授鑒定為Polyalthia plagioneura，標(biāo)本現(xiàn)藏于江西省腦血管藥理重點實驗室。

1.2 試驗方法

參照劉冰晶等的方法[8-9]并進(jìn)行改良。

1.2.1試驗溶液配制用0.2 mol/L氫氧化鈉滴加冰醋酸，調(diào)節(jié)pH值為4.5，即得醋酸—醋酸鈉緩沖溶液；稱取溴甲酚綠40 mg，加100 mL pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解，過濾，即得0.04%溴甲酚綠溶液。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作稱取干燥至恒重的小檗堿對照品2 mg，置于100 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100 mL，搖勻即得20 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。取小檗堿對照品溶液，顯色后進(jìn)行可見-紫外全波長掃描，結(jié)果表明對照品溶液在628 nm處有最大吸收峰。經(jīng)多次重復(fù)，峰形一致且空白對照無干擾，故選擇628 nm作為樣品測定的波長。取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.2、2.4、36、4.8、6.0、7.2 mL分別置于 20 mL 容量瓶中，用三氯甲烷稀釋至10 mL，加入pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液 5.0 mL 和0.04%溴甲酚綠溶液 2.0 mL，劇烈振搖5 min，靜置 30 min；取下層液5 mL，加入 0.01 mol/L 氫氧化鈉—乙醇溶液1.0 mL，搖勻，于628 nm處測吸光度。以小檗堿含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3空白溶液的制備取10 mL三氯甲烷溶液于20 mL容量瓶中，加入5.0 mL醋酸—醋酸鈉緩沖液和0.04%溴甲酚綠溶液2 mL，劇烈搖動5 min，然后靜置30 min；取下層液 5 mL，加入0.01 mol/L氫氧化鈉—乙醇溶液1.0 mL搖勻，作為空白溶液。

1.2.4斜脈暗羅總生物堿的提取分別準(zhǔn)確稱取斜脈暗羅莖0.5 g、葉0.25 g和皮0.5 g，用適量氨水濕潤，密封放置 30 min，索式提取2 h，將提取液置于碘化鉍鉀溶液經(jīng)薄層層析（TLC）至不顯色為止，回收三氯甲烷，殘留物放冷至室溫，用三氯甲烷溶解并定容至20 mL；取0.2 mL于容量瓶中，加三氯甲烷定容至10 mL，混勻作為樣品液；取10 mL樣品液于3個20 mL容量瓶中，加入5.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和 2 mL 0.04%溴甲酚綠溶液，劇烈搖動5 min，然后靜置 30 min；取下層液5 mL，加0.01 mol/L氫氧化鈉—乙醇溶液1.0 mL，搖勻，于628 nm處測吸光度，計算生物堿含量。試驗重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

經(jīng)過統(tǒng)計處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：D=0.008 2C+0.167 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，線性范圍為2.0～12.0 mg/L。

2.2穩(wěn)定性試驗

取斜脈暗羅提取溶液0.2 mL，每隔10 min用分光光度計測定1次吸光度，結(jié)果（表1）表明，斜脈暗羅莖、葉、皮提取物在1 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD值分別為2.140%、2.070%和0.379%。

3.3精密度試驗

取同一批樣品，進(jìn)行6次平行試驗，測定含量，斜脈暗羅莖、葉和皮提取物吸光度RSD值分別為0.385%、1.882%和0.412%，精密度良好（表2）。

3小結(jié)與討論

以小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)品，測定斜脈暗羅莖、葉和皮總生物堿分光含量分別為 0.267 1%、1.473 7%和0.790 8%。利用紫外分光光度法測定斜脈暗羅莖、葉、皮中總生物堿含量，操作簡便快捷，靈敏度高，重現(xiàn)性好，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該方法與重量法、滴定法等測定方法比較，克服了多次重復(fù)萃取所造成的誤差；與液相色譜法比較，具有所用儀器簡單、操作方便、耗時少的優(yōu)點。本研究結(jié)果可為斜脈暗羅的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。endprint

參考文獻(xiàn)：

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