NO／cGMP信號通路在鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血／再灌注損傷中的作用

胡 軍，張 野，陸 姚，蔣玲玲，何淑芳

（安徽醫(yī)科大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽合肥 230601；2.第三附屬醫(yī)院麻醉科，安徽合肥 230061）

心肌缺血／再灌注損傷是臨床心臟病學(xué)的重要難題，缺血的心肌在循環(huán)開放后發(fā)生比閉塞時更為嚴重的急性損傷；而鞘內(nèi)嗎啡處理可以對大鼠在體心肌缺血／再灌注損傷發(fā)揮保護作用［1-2］，因此鞘內(nèi)嗎啡處理可作為心肌保護的一種策略，具有實踐性意義。但鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理是如何介導(dǎo)心肌保護作用的機制尚未明確。有報道［3］證實中樞腦室內(nèi)給予嗎啡的抗缺血／再灌注損傷的心肌保護作用可能與其鎮(zhèn)痛作用和介導(dǎo)降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）的釋放有關(guān)。同時一氧化氮（nitric oxide，NO）作為中樞內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞內(nèi)參與疼痛、炎癥等多種傷害性刺激信號的調(diào)制［4］。心肌缺血／再灌注作為傷害性刺激，可引起中樞內(nèi)傷害性感覺神經(jīng)元興奮并介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［5］，實驗證明嗎啡等阿片受體激動劑在中樞可通過NO／cGMP信號通路發(fā)揮抗傷害性刺激作用［6］。因而本研究的目的在于探討NO／cGMP信號通路及其下游的蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）是否參與鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理抗心肌缺血／再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 鹽酸嗎啡注射液1 ml：10 mg（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：121206-2）。Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride（非選擇性的NO合成酶阻斷劑，L-NAME）、1H-［1，2，4］Oxadiazolo［4，3-a］quinoxalin-1-one（鳥苷酸環(huán)化酶阻斷劑，ODQ）、KT5823（PKG阻斷劑）、以上3種阻斷劑均購自Sigma公司。氯化三苯基四氮唑（TTC，Sigma公司，濃度為 100 mmol·L-1，磷酸鹽緩沖液pH 7.4溶解）。

1.2 動物模型

1.2.1 鞘內(nèi)置管動物模型的建立［1］本研究所用動物及實驗方法經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準。健康成年♂SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量（300±50）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（皖）2011-002。3% 戊巴比妥鈉60 mg·kg-1，ip。參照文獻［1］方法，沿脊柱在頸背部切開皮膚2 cm左右，游離肌肉組織，使寰枕膜顯露，用12G注射器針頭將寰枕膜輕刺小孔，見腦脊液從小孔流出，將PE-10導(dǎo)管從刺孔向尾端緩慢置入蛛網(wǎng)膜下腔4 cm，縫合傷口，固定導(dǎo)管。術(shù)后肌注青霉素10萬單位，單獨飼養(yǎng)3 d，常規(guī)飲食。有感覺或運動障礙的大鼠棄用。

1.2.2 心臟缺血／再灌注損傷模型的建立［1］鞘內(nèi)置管成功的大鼠，30%戊巴比妥鈉60 mg·kg-1，ip。麻醉后行氣管切開、插管后接動物呼吸機（ALCV9型，上海奧爾科特生物科技有限公司）以室內(nèi)空氣通氣，潮氣量20～30 ml·kg-1，頻率70～80次／分。右側(cè)股動脈切開置管，接壓力傳感器和生物機能系統(tǒng)（BL-420S型，成都泰盟生物科技有限公司），記錄心電圖（electrocardiogram，ECG）、平均動脈壓（mean arterial blood pressure，MAP）、心率（heart rate，HR）；右側(cè)股靜脈切開置管補液。在左側(cè)胸廓4-5肋間沿鎖骨中線切開皮膚約2 cm，并置開胸器打開胸腔，游離心包腔，輕壓胸廓右側(cè)，輕推出心臟；用6-0 Prolene線（強生公司，美國）在肺動脈圓錐與左心耳之間結(jié)扎左冠狀動脈后把心臟放回胸腔；再用Prolene線作一線結(jié)，收緊線結(jié)即可造成左冠狀動脈阻塞。心臟原位經(jīng)15 min穩(wěn)定，收緊線結(jié)以扎閉左冠狀動脈可使心肌缺血，缺血心肌表現(xiàn)為：冠狀動脈支配的區(qū)域發(fā)紺，血壓下降，ECG呈心肌缺血改變并可出現(xiàn)心律失常；松開線結(jié)后心肌實現(xiàn)再灌注，ECG在再灌注即刻可出現(xiàn)心律失常。

1.3 實驗方法 成功建立鞘內(nèi)置管模型的54只大鼠，隨機分為9組，每組6只：假手術(shù)組（SHAM組），大鼠在開胸后行冠狀動脈左前降支下穿線，但不結(jié)扎，也不給予其他處理；對照組（CON組），在缺血／再灌注前30 min內(nèi)，經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管微量泵恒速泵入生理鹽水10μl 5 min，間斷5 min，重復(fù)3次；鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理（ITMP組），在缺血／再灌注前30 min內(nèi)，經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管微量泵恒速泵入嗎啡（3μg·kg-1）［1］10μl 5 min，間斷5 min，重復(fù)3次；L-NAME+ITMP組、ODQ+ITMP組、KT5823+ITMP組分別在鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理前10 min鞘內(nèi)注射3種信號蛋白阻斷劑L-NAME（30 nmol）［7］、ODQ（11 nmol）、KT5823（20 pmol）［8］10μl；L-NAME組、ODQ組、KT5823組分別在缺血／再灌注前40 min鞘內(nèi)注射3種信號蛋白阻斷劑作為阻斷劑自身對照組。隨后除SHAM組，其余各組所有大鼠均經(jīng)歷30 min缺血，120 min再灌注（Fig 1）。

1.4 觀察指標

1.4.1 血流動力學(xué)指標測定 觀察各組手術(shù)完成心臟穩(wěn)定15 min后（基礎(chǔ)值）、預(yù)處理完成后即刻、缺血末和再灌注末平均動脈壓（MAP）和心率（HR），計算平均動脈壓和心率乘積（rate pressure product，RPP）。

Fig 1 Experiment protocol

1.4.2 心肌梗死面積測定 再灌注120 min后，取出心臟，剔除非心臟組織，置Langendorff K-H液灌注5 min（37℃），沖洗出心肌內(nèi)殘留血液，重新結(jié)扎左冠狀動脈，并從主動脈注入0.25%Evan藍溶液，后置-80℃冰箱速凍。將冰凍的心臟放入心肌切槽，由心尖到結(jié)扎冠脈的線結(jié)處平切2 mm厚的心肌5～6片。置1%TTC溶液中，37℃（pH 7.4）溫孵15 min，取出置10%福爾馬林室溫固定12 h。染色后缺血危險區(qū)呈紅色，梗死區(qū)為白色，用圖像分析軟件（Sigma Scan program 4）計算左心室體積（left ventricle，LV）、右心室體積（right ventricle，RV）、缺血危險區(qū)體積（area at risk，AAR）和梗死區(qū)體積（infarct size，IS），再算出 LV+RV，用 IS／AAR表示心肌梗死面積（Fig 2）。

Fig 2 Myocardial morphometric mapmorphometric map by TTC stainning.AAR：area of risk，IS：Infarct size

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以ˉx±s表示，對于血流動力學(xué)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量資料的方差分析；其他計量資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK分析。

2 結(jié)果

Tab 1 Hemodynamic parameters（±s，n＝6）

Tab 1 Hemodynamic parameters（±s，n＝6）

HR：heart rate（bpm）；MAP：mean arterial blood pressure（mmHg）；RPP：rate pressure product（mmHg／min／1000）.*P＜0.05 vs SHAM group；#P＜0.05 vs Baseline；1 mmHg＝0.133 kPa

Group Baseline Treatment Ischemia Reperfusion HR MAP RPP SHAM 367±26 84±14 31±6 365±37 85±10 31±5 367±3 HR MAP RPP HR MAP RPP HR MAP RPP 336±71 60±23 20±9 5 91±13 33±6 381±33 88±21 34±9 CON 387±50 82±13 32±9 393±21 87±20 34±9 357±38 57±11*#20±4*#349±51 66±13 23±6 ITMP 384±52 85±19 33±11 421±30 69±9 29±5 337±23 59±14*#20±5*#341±43 82±16 28±6 ITMP+L-NAME 384±44 85±16 33±10 398±37 80±7 32±2 375±31 64±14*#24±4*#377±41 65±15 25±8 ITMP+ODQ 394±24 82±14 32±7 384±26 87±9 33±3 389±34 55±13*#22±7*#382±49 65±16 25±7 ITMP+KT5823 387±33 86±18 34±9 351±45 76±10 26±4 384±60 56±15*#22±7*#355±43 61±13 22±4 NOS 376±35 88±24 34±13 383±41 93±14 36±8 383±21 72±10*#28±4*#315±98 70±23 23±12 ODQ 372±16 85±9 32±5 386±33 90±13 35±6 399±38 59±8*#23±4*#333±49 66±13 22±6 KT5823 374±30 85±15 32±8 383±40 87±8 33±3 368±26 68±13*#25±5*#

2.1 血流動力學(xué)指標 與SHAM組比較各組MAP和RPP在缺血末有降低 （P＜0.05），與基礎(chǔ)值比較，除SHAM組外，其余各組MAP和RPP在缺血末有降低（P＜0.05）（Tab 1）。

2.2 心臟病理指標改變 各組左心室體積（LV）與右心室體積（RV）之和、AAR體積差異無顯著性（P＞0.05）。與CON組相比，ITMP組的IS體積和IS／AAR均明顯降低 （P＜0.01）；與 ITMP組比較，LNAME+ITMP組、ODQ+ITMP組、KT5823+ITMP組的IS體積和IS／AAR均明顯升高（P＜0.01），表明NO／cGMP信號通路以及PKG的阻斷劑可消除鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理對心肌缺血／再灌注損傷的保護作用（Tab 2）。

Tab 2 Myocardial morphometric analysis±s，n＝6）

Tab 2 Myocardial morphometric analysis±s，n＝6）

LV：left ventricle；RV：right ventricle；AAR：area at risk；IS：infarct size.**P＜0.01 vs CONgroup；##P＜0.01 vs ITMPgroup

Group LV+RVvolume／cm3 AARvolume／cm3 ISvolume／cm3IS／AAR／%.9 SHAM 0.87±0.06 0.46±0.06 0 0 CON 0.84±0.06 0.42±0.03 0.22±0.03 51.3±5.7 ITMP 0.74±0.07 0.41±0.03 0.12±0.03**29.7±5.0**L-NAME+ITMP 0.86±0.05 0.42±0.04 0.22±0.01## 53.4±6.1##ODQ+ITMP 0.79±0.09 0.44±0.03 0.22±0.02## 48.9±5.2##KT5823+ITMP 0.81±0.04 0.45±0.05 0.23±0.04## 49.8±7.2##L-NAME 0.85±0.09 0.44±0.02 0.24±0.05 50.9±5.9 ODQ 0.85±0.10 0.43±0.06 0.21±0.02 50.0±2.6 KT5823 0.83±0.04 0.42±0.04 0.22±0.03 52.7±7

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理可以減輕心肌缺血／再灌注損傷，并且脊髓內(nèi)神經(jīng)元的NO／cGMP信號通路，及其下游的PKG可能參與介導(dǎo)這種心肌保護作用。

脊髓內(nèi)傷害性感覺神經(jīng)元作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，不但接受外周傷害性刺激的傳入，還可以通過其末梢釋放神經(jīng)肽調(diào)節(jié)外周血管舒張［9］。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)中樞腦室內(nèi)嗎啡預(yù)處理，就可以介導(dǎo)具有強烈血管舒張作用的神經(jīng)肽-降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）在外周釋放［10］。缺血、疼痛以及炎癥等作為傷害性刺激可以通過心臟感覺神經(jīng)（Aδ和C纖維）引起脊髓內(nèi)傷害性感覺元的興奮，并導(dǎo)致脊髓內(nèi)的P物質(zhì)表達增加［5］。而NO作為中樞內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，對傷害性信號的感知有雙重調(diào)節(jié)作用［4］。很多研究都證實NO作為阿片受體激動劑的重要中間介質(zhì)在中樞和外周調(diào)節(jié)其抗傷害作用［7，11-12］。嗎啡可以刺激3種類型的NO合酶在體內(nèi)的合成，升高NO合酶mRNA和神經(jīng)性NO合成酶 （neuronal nitric oxide synthase，nNOS）的表達［6］。NO通過作用于鳥苷酸環(huán)化酶（GC）誘導(dǎo)GTP的環(huán)化生成cGMP［4］。同時NO／cGMP也介導(dǎo)其他阿片受體激動劑的抗傷害鎮(zhèn)痛作用［13］；綜合起來看，NO／cGMP可能是阿片藥物發(fā)揮抗傷害鎮(zhèn)痛作用的基礎(chǔ)信號傳導(dǎo)通路。在我們的研究里通過鞘內(nèi)注射NO合成酶阻斷劑L-NAME或者鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑ODQ都可以阻斷嗎啡的心肌保護效應(yīng)。

NO／cGMP的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制可能與激活蛋白激酶G（PKG）開放細胞膜ATP敏感性K+通道有關(guān)，PKG作為cGMP下游信號蛋白可以活化ATP敏感性K+通道［14］。此外也有研究顯示出ATP敏感性K+通道的激活劑可以增強阿片藥物的抗傷害鎮(zhèn)痛作用［15］。據(jù)此我們推斷嗎啡可能是通過NO／cGMP信號通路，激活其下游PKG調(diào)節(jié)脊髓傷害性刺激感受神經(jīng)元的ATP敏感性K+通道，形成K+外流，使細胞膜超極化，提高神經(jīng)元興奮閾值，增強其對缺血等傷害性刺激的耐受而減輕心肌缺血／再灌注損傷，誘導(dǎo)心肌保護效應(yīng)。在實驗中通過鞘內(nèi)注射PKG的阻斷劑KT5823，阻斷鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理的心肌保護作用。同時也有研究證明NO可以通過胸段脊髓交感節(jié)前神經(jīng)元對調(diào)節(jié)心血管活動［16］，但是在我們的研究中，在各實驗組中未能發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)給予嗎啡或NO／cGMP信號通路相關(guān)阻斷劑對血流動力學(xué)參數(shù)有影響，這可能是其藥物處理的方式與我們的研究不同而致。

我們的研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理對在體大鼠心肌缺血／再灌注損傷的保護作用可能與NO／cGMP信號通路以及其下游的PKG有關(guān)。

參考文獻：

［1］ 李 銳，張 野，張 健，等.中樞阿片受體介導(dǎo)鞘內(nèi)注射嗎啡對大鼠缺血后心肌的保護作用 ［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24（5）：676-80.

［1］ Li R，Zhang Y，Zhang J，et al.Cardioprotective effect of intrathecal morphine on ischemia-reperfusion injury heart mediated by opioid receptors in central nervous system ［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24（5）：676-80.

［2］ 蔣玲玲，張 野，翁立軍，等.中樞嗎啡后處理對在體大鼠缺血后心肌的保護作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25（2）：177-81.

［2］ Jiang L L，Zhang Y，Weng L J，et al.Cardioprotective effects of intracerebroventricular morphine postconditioning against ischemiareperfusion injury in rat heart［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（2）：177-81.

［3］ Zhang Y，Irwin M G，Lu Y，et al.Intracerebroventricular administration of morphine confers remote cardioprotection-role of opioid receptors and calmodulin［J］.Eur JPharmacol，2011，656（1-3）：74-80.

［4］ Cury Y，Picolo G，Gutierrez V P，et al.Pain and analgesia：The dual effect of nitric oxide in the nociceptive system［J］.Nitric Oxide，2011，25（3）：243-54.

［5］ Steagall R J，Sipe A L，Williams CA，et al.Substance Prelease in response to cardiac ischemia from rat thoracic spinal dorsal horn is mediated by TRPV1［J］.Neuroscience，2012，214：106-19.

［6］ Toda N，Kishioka S，Hatano Y，et al.Modulation of opioid actions by nitric oxide signaling［J］.Anesthesiology，2009，110（1）：166-81.

［7］ Brock SC，Tonussi C R.Intrathecally injected morphine inhibits inflammatory paw edema：the involvement of nitric oxide and cyclic-guanosine monophosphate［J］.Anesth Analg，2008，106（3）：965-71，table of contents.

［8］ Morita K，Kitayama T，Morioka N，et al.Glycinergic mediation of tactile allodynia induced by platelet-activating factor（PAF）through glutamate-NO-cyclic GMPsignalling in spinal cord in mice［J］.Pain，2008，138（3）：525-36.

［9］ Hollis M，Wang D H.Transient receptor potential vanilloid in blood pressure regulation［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2013，22（2）：170-6.

［10］陸 姚，范禮斌，張 野，等.中樞嗎啡預(yù)處理對心臟缺血后大鼠海馬CaM、血漿CGRP以及下丘腦室旁核和心肌P物質(zhì)表達的影響 ［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25（8）：1072-7.

［10］Lu Y，F(xiàn)an L B，Zhang Y，et al.Effects of intracerebroventricular morphine preconditioning on expression of calmodulin in hippocampus，calcitonin gene related peptide in plasma，substance Pin hypothalamic paraventricular nucleus and myocardium in myocardial postischemia injury rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（8）：1072-7.

［11］Cunha T M，Roman-Campos D，Lotufo CM，et al.Morphine peripheral analgesia depends on activation of the PI3Kgamma／AKT／nNOS／NO／KATP signaling pathway［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（9）：4442-7

［12］Schmidtko A，Tegeder I，Geisslinger G.No NO，no pain？The role of nitric oxide and cGMP in spinal pain processing［J］.Trends Neurosci，2009，32（6）：339-46.

［13］Hervera A，Leanez S，Negrete R，et al.The peripheral administration of a nitric oxide donor potentiates the local antinociceptive effects of a DOR agonist during chronic inflammatory pain in mice［J］.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2009，380（4）：345-52.

［14］Kawano T，Zoga V，Kimura M，et al.Nitric oxide activates ATP-sensitive potassium channels in mammalian sensory neurons：action by direct S-nitrosylation［J］.Mol Pain，2009，14（3）：5-12.

［15］Alves D P，Soares A C，F(xiàn)rancischi JN，et al.Additive antinociceptive effect of the combination of diazoxide，an activator of ATP-sensitive K+channels，and sodium nitroprusside and dibutyrylcGMP［J］.Eur J Pharmacol，2004，489（1-2）：59-65.

［16］Sabino JP，Bombarda G，da Silva CA，et al.Role of the spinal cord NO／cGMP pathway in the control of arterial pressure and heart rate［J］.Pflugers Arch，2011，461（1）：23-8.