白麗淼,黃曉峰,徐寒梅
(1.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇南京 210009;2.南京市口腔醫(yī)院病理科,江蘇南京 210008)
新生血管對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是必不可少的[1]。腫瘤的血管新生是一個(gè)受到多種因子共同作用的復(fù)雜過(guò)程。腫瘤組織內(nèi)血管的增生情況反映了腫瘤誘導(dǎo)血管新生的能力,檢測(cè)腫瘤的微血管密度(microvessel density,MVD),作為反映腫瘤血管生長(zhǎng)的指標(biāo),具有重要意義[2]。CD105為一種同源異體細(xì)胞膜糖蛋白,是TGF-β受體復(fù)合物成分之一。有研究表明,CD105可特異性地表達(dá)于高增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)能夠增加血管通透性,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、血管構(gòu)建、遷移,對(duì)腫瘤的新生血管生成起著決定性作用,是目前已知最關(guān)鍵的促進(jìn)血管生成因子[4]。缺氧是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移的起始因素,缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α在腫瘤血管的生成過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。缺氧通過(guò)兩種方式促進(jìn)血管生成:一方面HIF-1α可直接增加促進(jìn)血管生長(zhǎng)的因子表達(dá),如促進(jìn) VEGF、VEGFR1、IL-8、血管生成素(angiogenin)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)的表達(dá),以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及血管生成;另一方面缺氧可降低血管生成抑制因子的活性,為血管新生提供合適的環(huán)境[5]。
腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多階段性的連續(xù)過(guò)程,腫瘤組織在不同時(shí)期存在特定的微環(huán)境[6]。而血管在腫瘤生長(zhǎng)不同時(shí)期是否存在不同的特征尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法研究了不同體積的HT-29裸鼠移植瘤組織內(nèi) CD31、CD105、VEGF、HIF-1α的表達(dá)情況,以探討腫瘤不同階段的微血管密度和血管相關(guān)因子的表達(dá),為血管生成抑制劑類(lèi)抗腫瘤藥物的合理用藥提供依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c裸小鼠,SPF級(jí),5~7周齡,♀,體質(zhì)量(15±2)g,購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2011-0003。人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。
1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);青霉素、鏈霉素(美國(guó)Amresco公司);HIF-1α和VEGF一抗均為兔抗人單克隆抗體,CD31和CD105一抗均為鼠抗人單克隆抗體,均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;免疫組化試劑盒(鼠兔通用)購(gòu)自Dako公司。
2.1 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 復(fù)蘇凍存的HT-29細(xì)胞,置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞,將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升2.5×107個(gè)細(xì)胞,接種于BALB/c裸小鼠右側(cè)前肢腋部皮下,每只小鼠接種0.2 ml。2周后15只裸鼠全部成瘤。根據(jù)移植瘤生長(zhǎng)情況將15只荷瘤裸小鼠按照腫瘤大小分為3組,每組5只。3組移植瘤的大小分別為<100 mm3、100~300 mm3、>300 mm3。
2.2 免疫組化檢測(cè) 免疫組化采用Envision兩步法。所有標(biāo)本均經(jīng)中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、3 μm連續(xù)切片、脫蠟,EDTA pH 8.0高溫抗原修復(fù),滴加相應(yīng)一抗,4℃過(guò)夜,PBS洗滌后加二抗37℃孵育,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,以已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。
2.3 結(jié)果判定 ①微血管密度的計(jì)數(shù):腫瘤組織中的微血管均染為棕黃色,陽(yáng)性定位在血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。按Weidner法[7]對(duì)MVD進(jìn)行計(jì)數(shù),即先在低倍鏡(×100)下查看整張切片,找到腫瘤組織的微血管密集區(qū),再在高倍鏡(×200)下選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)血管數(shù),取其平均值作為此樣本的MVD值。任何一個(gè)被染為棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇,只要與相鄰的微血管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織界限分明,都被認(rèn)為是一個(gè)微血管,進(jìn)行計(jì)數(shù)。管腔大于8個(gè)細(xì)胞或帶有較厚肌層的血管不計(jì)數(shù);②VEGF表達(dá)的判定:細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃顆粒為陽(yáng)性表達(dá),400倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)不同視野,分別計(jì)數(shù)整個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù),取其比值作為陽(yáng)性表達(dá)率,5個(gè)數(shù)值的平均值作為該樣本的陽(yáng)性表達(dá)率;③ HIF-1α表達(dá)的判定:陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核,計(jì)數(shù)方法同VEGF。
2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,組間差異的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。
Tab 1 Expression of vascular-related factors for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages(±s,n=5)
Tab 1 Expression of vascular-related factors for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages(±s,n=5)
*P<0.05,**P<0.01 G1 vs G2,and G2 vs G3
Group Tumor volume/mm3 CD31-MVD CD105-MVD VEGF expression/% HIF-1αexpression/%G1 <100 37.40±4.17 22.80±3.54 26.20±0.83 3.20±2.97 G2 100~300 18.80±1.72** 15.60±1.35* 40.73±6.29** 11.89±1.94**G3 >300 14.20±2.23* 10.20±2.48* 13.41±1.20** 80.62±3.47**
Fig 1 Expression of CD31 for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A:<100 mm3,B:100~300 mm3,C:>300 mm3
3.1 染色結(jié)果 CD31陽(yáng)性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),呈棕黃色顆粒。在腫瘤組織內(nèi)的微血管和大血管上均有表達(dá),與其他組織可清晰分辨(Fig 1)。CD105也將血管內(nèi)皮細(xì)胞染為棕黃色,與CD31比較,多染色于微小血管上,血管內(nèi)皮細(xì)胞排列不規(guī)則,與其他組織可清晰分辨。在大血管上染色不明顯,分布不均勻,腫瘤組織的邊緣區(qū)表達(dá)強(qiáng)烈(Fig 2)。VEGF陽(yáng)性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,表現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在腫瘤組織內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)也有表達(dá)(Fig 3)。HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),染為棕黃色。在腫瘤組織的壞死區(qū)及其邊緣表達(dá)明顯(Fig 4)。
3.2 腫瘤不同階段 CD31、CD105、VEGF、HIF-1α的表達(dá) 從Tab 1可以看出,隨著腫瘤體積的增大:① CD31-MVD值分別為 37.40±4.17、18.80±1.72、14.20±2.23,CD105-MVD值分別為22.80±3.54、15.60±1.35、10.20±2.48。即體積增大,組織內(nèi)微血管密度減小,各組間t檢驗(yàn)結(jié)果顯示P<0.05,差異有顯著性;裸鼠移植瘤不同體積時(shí)CD31-MVD、CD105-MVD的變化趨勢(shì)見(jiàn)Fig 5;②VEGF陽(yáng)性表達(dá)率先增后減,分別為 26.20% ±0.83%、40.73%±6.29%、13.41%±1.20%。腫瘤體積在100~300 mm3時(shí)表達(dá)最多,體積繼續(xù)增大,VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率減?。虎?組織內(nèi)部的壞死程度逐漸加大,HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)增加,分別為 3.20% ±2.97%、11.89%±1.94%、80.62%±3.47%。特別是在壞死區(qū)域和壞死邊緣區(qū)域,HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)明顯。裸鼠移植瘤不同體積時(shí)VEGF、HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)變化見(jiàn)Fig 6。
Fig 2 Expression of CD105 for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A:<100 mm3,B:100~300 mm3,C:>300 mm3
Fig 3 Expression of VEGF for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A:<100 mm3,B:100~300 mm3,C:>300 mm3
Fig 4 Expression of HIF-1αfor xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A:<100 mm3,B:100~300 mm3,C:>300 mm3
Fig 5 CD31-MVD and CD105-MVD for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages
早在20世紀(jì)初,Goldman就發(fā)現(xiàn)了血管?chē)@腫瘤生成的現(xiàn)象。1971年,F(xiàn)olkman提出腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與血管生成密不可分。在無(wú)血管狀態(tài)下,腫瘤的營(yíng)養(yǎng)獲得來(lái)源于簡(jiǎn)單的被動(dòng)擴(kuò)散,腫瘤生長(zhǎng)直徑不會(huì)超過(guò)2 mm。新生血管給腫瘤帶來(lái)了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣,并將腫瘤細(xì)胞與循環(huán)系統(tǒng)聯(lián)系到一起,為腫瘤轉(zhuǎn)移提供機(jī)會(huì)[8]。腫瘤血管已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn),是最有希望的腫瘤導(dǎo)向治療的靶標(biāo)。
CD105又名 Endoglin,是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)受體復(fù)合物成分之一。定位于人染色體9q34,分子質(zhì)量為180 ku。TGF-β能降低毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度,并且可誘導(dǎo)缺乏CD105的內(nèi)皮細(xì)胞死亡。抑制人內(nèi)皮細(xì)胞中CD105蛋白的翻譯,可增強(qiáng)TGF-β對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和游走的抑制功能,說(shuō)明CD105可抑制TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)[9]。有研究表明,CD105在多種實(shí)體瘤上高度表達(dá),其與病人的生存率和轉(zhuǎn)移率密切相關(guān)。黃小娟等[10]實(shí)驗(yàn)表明,MVD-CD105與組織學(xué)分級(jí)、腹水、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。CD105表達(dá)越高,腫瘤組織學(xué)分級(jí)越高,腫瘤患者的預(yù)后越差。CD105可優(yōu)先表達(dá)于腫瘤的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上,相對(duì)于Von Willebrand因子、CD31和CD34更具特異性,對(duì)腫瘤血管的診斷具有更高的參考價(jià)值[11]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象,CD105的陽(yáng)性表達(dá)集中在腫瘤的邊緣區(qū),在移植瘤不同體積時(shí),陽(yáng)性染色多為單層內(nèi)皮細(xì)胞圍成的管腔。而在移植瘤體積大于300 mm3的樣本中,用CD31標(biāo)記的血管出現(xiàn)分支和大血管。從數(shù)量上比較,HT-29裸鼠移植瘤在不同時(shí)期CD105-MVD、CD31-MVD值差異均存在顯著性(P<0.01)。
腫瘤的血管生成與其所處的微環(huán)境中血管形成因子有關(guān)。VEGF是一種重要的促進(jìn)血管生成因子。VEGF通過(guò)與受體KDR特異性結(jié)合,發(fā)揮其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促進(jìn)分化和趨化作用,從而促進(jìn)血管新生,所以研究腫瘤組織中VEGF的表達(dá)情況具有重要意義。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),不僅腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF,間質(zhì)細(xì)胞也大量表達(dá)。HT-29裸鼠移植瘤在不同體積時(shí),VEGF的表達(dá)量不同。在腫瘤體積小于300 mm3時(shí),VEGF的表達(dá)量較高,當(dāng)腫瘤體積繼續(xù)增大時(shí),VEGF的表達(dá)量減少。所以在腫瘤體積較小時(shí)應(yīng)用VEGF抑制劑類(lèi)抗腫瘤藥物,可能會(huì)獲得好的療效。
Fig 6 Expression of VEGF and HIF-1αfor xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages
HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β組成的具有轉(zhuǎn)錄活性的異源二聚體。其中HIF-1β在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),HIF-1α在氧壓正常時(shí)被蛋白酶迅速降解,而在缺氧時(shí),其半衰期延長(zhǎng),與HIF-1β結(jié)合成一個(gè)完整的HIF-1轉(zhuǎn)錄子,調(diào)控缺氧相關(guān)基因的表達(dá),所以HIF-1α為HIF的氧調(diào)節(jié)亞單位[12]。在HT-29裸鼠移植瘤不同瘤體積時(shí)檢測(cè)HIF-1α的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn),隨著腫瘤體積的增大,腫瘤壞死面積增加,HIF-1α的表達(dá)率升高。在腫瘤組織的壞死區(qū)域及邊緣區(qū),HIF-1α明顯表達(dá)。腫瘤體積增大,腫瘤組織內(nèi)血管密度減少,供血不足導(dǎo)致組織得不到充足的氧氣和養(yǎng)分,出現(xiàn)缺氧,常規(guī)藥物無(wú)法進(jìn)入組織內(nèi)部,難以達(dá)成治療效果。
腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移不僅與腫瘤細(xì)胞本身有關(guān),與其所處的微環(huán)境也密不可分。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中,由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等)和細(xì)胞外基質(zhì)等共同組成的腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境,是腫瘤生理學(xué)、結(jié)構(gòu)和功能的一個(gè)組成部分[13]。從本實(shí)驗(yàn)中我們可以發(fā)現(xiàn),HT-29裸鼠移植瘤在不同體積時(shí),腫瘤組織內(nèi)各種細(xì)胞因子的表達(dá)情況不同。所以在腫瘤治療時(shí),腫瘤微環(huán)境為一個(gè)重要的考量因素。
惡性腫瘤是一個(gè)多因素、多基因、多階段的病理過(guò)程。在腫瘤不同階段,基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)呈現(xiàn)不同的規(guī)律[14]。只有給予適時(shí)的、恰當(dāng)?shù)乃幬镏委?,才能達(dá)到預(yù)期的治療效果。血管抑制劑類(lèi)藥物雖然在臨床上取得了巨大的成功和銷(xiāo)售利潤(rùn),但其開(kāi)發(fā)歷史相對(duì)其他腫瘤化學(xué)治療藥物較短,其藥理學(xué)研究還不夠深入,非常有必要在其臨床藥理或臨床前藥理學(xué)方面進(jìn)行深入的研究,以便為其更合理使用提供重要參考。在給予血管生成抑制劑類(lèi)抗腫瘤藥物時(shí),一定要考慮到腫瘤所處的階段,只有在腫瘤發(fā)生發(fā)展恰當(dāng)?shù)臅r(shí)期給予相應(yīng)的、恰當(dāng)?shù)目鼓[瘤藥物治療,才可能達(dá)到預(yù)期的效果。在腫瘤的治療中應(yīng)注意:(1)研究不同腫瘤、腫瘤不同時(shí)期的微環(huán)境,從而采取個(gè)性化治療方案;(2)以腫瘤的微環(huán)境為靶點(diǎn),開(kāi)發(fā)多靶點(diǎn)藥物或多種干預(yù)手段聯(lián)合應(yīng)用,從而取得期待的治療或預(yù)后。本文結(jié)果說(shuō)明,在腫瘤分化早期,CD31-MVD、CD105-MVD、VEGF的表達(dá)水平高,此時(shí)給予相應(yīng)的血管抑制劑治療會(huì)收效明顯;在腫瘤分化中晚期,腫瘤組織內(nèi)部缺氧程度增加,HIF-1α過(guò)度表達(dá),此時(shí)給予 HIF-1α抑制劑,如p300/CBP抑制劑JG-ODN、sGC刺激劑YC-1、HSP90抑制劑等對(duì)于改善組織缺氧狀態(tài),抑制腫瘤生長(zhǎng)和抑制血管生成具有重要意義[15]。
參考文獻(xiàn):
[1] Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent[J]?J Natl Cancer Inst,1990,82(1):4-6.
[2] Schimming R,Reusch P,Kuschnierz J,et al.Angiogenic factors in squamous cell carcinoma of the oral cavity:do they have prognostic relevance[J].JCraniomaxillofac Surg,2004,32(3):176-81.
[3] Takase Y,Kai K,Masuda M,et al.Endoglin(CD105)experssion and angiogenesis status in small cell lung cancer[J].Pathol Res Pract,2010,206(11):725-30.
[4] M?kinen T,Veikkola T,Mustjoki S,et al.Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth,survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3[J].EMBO J,2001,20(17):4762-73.
[5] Ruan K,Song G,Ouyang G.Role of hypoxia in the hallmarks of human cancer[J].J Cell Biochem,2009,107(6):1053-62.
[6] Hanahan D,Weinberg R A.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144(5):646-74.
[7] Weidner N,Semple J P,Welch W R,et al.Tumor angiogenesis and metastasis——correlation in invasive breast carcinoma[J].N Engl J Med,1991,324(1):1-8.
[8] Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications[J].N Engl J Med,1971,285(21):1182-6.
[9] Li C,Hampson I N,Hampson L,et al.CD105 antagonizes the inhibitory signaling of transforming growth factor betal on human vascular endothelial cells[J].FASEB J,2000,14(1):55-64.
[10]黃小娟,齊文慧,王 立,等.CD31和CD105在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)及其臨床病理意義[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué),2012,21(6):544-50.
[10]Huang X J,Qi WH,Wang L,et al.Expression and clinicopathological significance of CD31 and CD105 in ovarian epithelial carcinoma[J].Chin J Histochem Cytochem,2012,21(6):544-50.
[11] Dallas N A,Samuel S,Xia L,et al.Endoglin(CD105):a marker of tumor vasculature and potential target for therapy[J].Clin Cancer Res,2008,14(7):1931-7.
[12]李玉娟,劉建勛.HIF-1活性調(diào)節(jié)及其在缺血后血管新生中的作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2009,25(1):19-20.
[12]Li Y J,Liu JX.Key regulators of HIF-1 and its action in angiogenesis after ischemia[J].Chin Pharmacol Bull,2009,25(1):19-20.
[13]Mbeunkui F,Johann D J Jr.Cancer and the tumor microenvironment:a review of an essential relationship[J].Cancer Chemother Pharmacol,2009,63(4):571-82.
[14]李夏雨,沈守榮,武明花,等.對(duì)基因遺傳性腫瘤不同階段轉(zhuǎn)錄組學(xué)調(diào)控規(guī)律及其分子機(jī)制[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,36(7):585-91.
[14]Li X Y,Shen SR,Wu M H,et al.Transcriptomic regulation and molecular mechanism of polygenic tumor at different stages[J].J Cent South Univ(Med Sci),2011,36(7):585-91.
[15]吳 琪,霍興華.以HIF-1α為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥的研究現(xiàn)狀[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,32(7):1119-21.
[15]Wu Q,Huo X H.Drugs development in anti-tumor therapy by targeting of HIF-1α[J].J Qiqihar Med Coll,2011,32(7):1119-21.