高效液相色譜法測(cè)定消渴平膠囊中鹽酸小檗堿含量

趙嚴(yán)麗，陳淑娟

（1．廣東省河源市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 河源 517000； 2．廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808）

消渴平膠囊是由人參、黃連、天花粉、天冬、黃芪、丹參、枸杞子、沙苑子、葛根、知母、五倍子、五味子等12味中藥組方，具有益火養(yǎng)陰、清熱瀉火的功效，用于陰虛燥熱、氣陰兩虛所致的消渴病。處方中黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒作用，鹽酸小檗堿對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、傷寒桿菌及阿米巴原蟲(chóng)有抑制作用。本試驗(yàn)以其所含有效成分之一鹽酸小檗堿為指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定方中鹽酸小檗堿的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC－2010 A型高效液相色譜儀(日本島津公司)，UV－1601型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；AG－135型電子分析天平(Mettler公司，準(zhǔn)確度為 0．01 mg)；KQ250DA型超聲清洗器。鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110713－200911，含量為 86．8%，供含量測(cè)定用)；消渴平膠囊（吉林益民制藥有限公司，批號(hào)分別為 20100902，20101006，20110609，規(guī)格為每粒0．4 g）；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸均為分析純，水為超純水，十二烷基磺酸鈉（化學(xué)試劑，上海雙龍化學(xué)品廠）。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Inertsil C18柱 (250 mm ×4．6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0．1%磷酸溶液（每 100 mL加十二烷基磺酸鈉 0．1 g）－乙腈(52 ∶48)；測(cè)定波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：30 ℃ ；流速：1．0 mL ／min；進(jìn)樣量：5 μL。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2．2 溶液制備

精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成0．206 4 g／L的對(duì)照品貯備液；再精密量取對(duì)照品貯備液適量，加甲醇制成10．32 μg／mL的對(duì)照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下的樣品內(nèi)容物約0．6 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸 － 甲醇（1∶100）50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，置 60℃水浴 15 min，取出，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用鹽酸 －甲醇（1∶100）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取處方中除黃連外的其余藥材，按處方量依法制成粉末，再按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：分別精密吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液和對(duì)照品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1）。可見(jiàn)，供試品溶液色譜中，在與鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾，表明方法可行。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密吸取質(zhì)量濃度為 10．32 μg／mL的對(duì)照品溶液 3，4，5，6，7 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)量峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸小檗堿回歸方程 A＝23 513 C －66．1，r＝0．999 9（n＝5）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在 0．030 95～0．072 25 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液（10．32 μg／mL）5 μL，重復(fù)進(jìn)樣 6次。結(jié)果峰面積的 RSD為 0．42%（n＝6），表明儀器精密度較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品（批號(hào)為20100902）溶液，室溫下放置，于 0，4，8，12，18，24 h 時(shí)分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD 為0．43%（n＝5），表明供試品溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20100902）6份，每份約0．6 g，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果鹽酸小檗堿含量為0．791 7 mg／g，RSD為0．56%（n＝6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱(chēng)取已知含量的樣品（批號(hào)為20100902，鹽酸小檗堿含量為 0．791 7 mg ／g，平均每粒重 0．428 4 g）約 0．3 g，共 6份。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品 12．23 mg，用甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為 0．053 08 g／L的溶液，精密量取 4，5，6 mL各2份，加入到6份樣品中，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2．4 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定3批樣品的鹽酸小檗堿峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)為 20100902，20101006，20110609的 3批樣品，平均粒重分別為 0．408 2，0．405 4，0．403 8 g，平均 含 量分別為0．339 2，0．315 4，0．341 5 mg ／粒。

3 討論

用紫外分光光度計(jì)對(duì)對(duì)照品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果在265 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收。故選擇265 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

在供試品溶液制備方法中，曾選用超聲、水浴、冷浸等方法[1]，比較了水浴和超聲時(shí)間，結(jié)果以鹽酸－甲醇（1∶100）混合溶液在60℃水浴15 min再超聲處理30 min的方法，提取完全，含量較穩(wěn)定；試驗(yàn)中比較了兩種不同比例的流動(dòng)相，即0．1%磷酸溶液－乙腈（70 ∶30）和 0．1% 磷酸溶液 － 乙腈（52 ∶48）[2－3]，結(jié)果表明，選擇0．1%磷酸溶液－乙腈（52∶48）作為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖基線較穩(wěn)，樣品中鹽酸小檗堿與其他雜質(zhì)峰能夠完全分離，鹽酸小檗堿的理論板數(shù)大于4 000。本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性及回收率均理想，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]胡安青．HPLC法同時(shí)測(cè)定金雞片中鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量[J]．中國(guó)藥師，2012，15（11）：1 590 －1 592．

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[3]YBZ05142006－2009，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S]．