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    法舒地爾聯(lián)合谷氨酸降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率☆

    2014-04-27 07:14:40陳舒羅銘蔡望青何明亮陳美惠劉安民
    中國神經(jīng)精神疾病雜志 2014年6期
    關(guān)鍵詞:舒地爾人腦谷氨酸

    陳舒 羅銘 蔡望青 何明亮 陳美惠 劉安民

    法舒地爾聯(lián)合谷氨酸降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率☆

    陳舒*羅銘**蔡望青*何明亮*陳美惠△劉安民*

    目的 觀察Rho激酶抑制劑法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞NMDAR-1表達(dá)和聯(lián)合谷氨酸降低細(xì)胞存活率。方法使用法舒地爾干預(yù)原代人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h后再加入谷氨酸共同培養(yǎng)細(xì)胞24h。相差顯微鏡觀察法舒地爾對細(xì)胞形態(tài)變化的影響;噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞的存活率;免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡檢測谷氨酸受體的表達(dá)變化。結(jié)果經(jīng)過法舒地爾干預(yù)48h后,免疫熒光(NMDAR-1陽性細(xì)胞百分比計(jì)數(shù):空白對照組18.9%±3.7%,Fas100μmol/L組79.4%±6.4%,P<0.05)和蛋白質(zhì)印跡表明谷氨酸受體的表達(dá)明顯升高(Fas50μmol/ L組相對密度:Blank組4.07±1.04倍,P<0.05,F(xiàn)as100μmol/L組為4.89±0.96倍,P<0.05),谷氨酸能明顯降低經(jīng)法舒地爾處理后的細(xì)胞的存活率(空白對照組與空白對照+谷氨酸組吸光度分別為1.47±0.11和1.34±0.20,P>0.05;Fas50μmol/L組和Fas50μmol/L+谷氨酸組為0.98±0.16和0.66±0.15,P<0.05;Fas100μmol/L組和Fas100μmol/ L+谷氨酸組為0.89±0.13和0.49±0.17,P<0.05)。結(jié)論法舒地爾可以誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞谷氨酸受體的表達(dá)增高,從而可以聯(lián)合谷氨酸發(fā)揮谷氨酸興奮性毒性達(dá)到更好的抗膠質(zhì)瘤的作用。

    法舒地爾 膠質(zhì)瘤 谷氨酸 NMDAR-1

    腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤,目前對于膠質(zhì)瘤的治療仍然不能取得滿意的療效。目前對于膠質(zhì)瘤的治療已經(jīng)有了很多發(fā)現(xiàn),其中法舒地爾作為唯一應(yīng)用于臨床上的Rho激酶抑制劑被廣泛應(yīng)用于蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中[1,2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)[3,4],法舒地爾可明顯誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡、抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是細(xì)胞谷氨酸受體的一種亞型,能引起鈣離子通道開放,鈣離子內(nèi)流使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,造成細(xì)胞凋亡[5],這可能作為膠質(zhì)瘤治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)[6]。但是人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺乏谷氨酸受體[7-9],因此如何增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中谷氨酸受體的表達(dá)使之成為治療靶點(diǎn)是目前急需解決的問題。原代培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞保留原來的遺傳特性,最接近和反映體內(nèi)生長特性,是理想的基因表達(dá)和藥物毒性體外試驗(yàn)?zāi)P蚚10]。因此,在本研究中我們應(yīng)用法舒地爾誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞表達(dá)NMDAR-1的情況,并聯(lián)合谷氨酸探討抗膠質(zhì)瘤的可能作用。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本來自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)外科,術(shù)前經(jīng)患者知情同意,術(shù)后病理診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOⅣ)。DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清(Gibco公司);二甲基亞砜(DMSO),Hochest 33258,谷氨酸(Glu)和噻唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma公司,谷氨酸純度>98%);法舒地爾(大連美倫,純度>98%);兔多克隆抗NMDAR1抗體(武漢博士德);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(Thermo Scientific公司);Alexa 555標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗,青霉素-鏈霉素,RIPA裂解液,TritonX-100(碧云天);PVDF膜(Millipore公司);激光共聚焦顯微鏡,CK2型倒置相差顯微鏡(Olympus,日本);酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

    1.2 人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)取下標(biāo)本后1h內(nèi)浸泡在含1%青霉素-鏈霉素的PBS中,小心去除組織上的血管、腦膜等非腫瘤組織。將組織剪成大小約為1cm3的小塊,0.25%胰酶消化10~15min。吸取上清,向上清液中加入含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMED培養(yǎng)液,1200 r/min離心5min后棄上清,加入相同培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞以每毫升105個(gè)密度接種于培養(yǎng)瓶中,置于5%CO2、37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h后換液,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%融合度時(shí)傳代。

    1.3 法舒地爾干預(yù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞將細(xì)胞接種到48孔板上,培養(yǎng)24h后分別加入不同濃度的法舒地爾(F)處理細(xì)胞,設(shè)立空白對照組(單純DMEM)、法舒地爾50μmol/L、法舒地爾100μmol/L,并每組設(shè)立2個(gè)副孔,48h后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

    1.4 MTT比色法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活率人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于96孔板上,24h后用含不同濃度的法舒地爾(0,50,100 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48h,每個(gè)濃度設(shè)12個(gè)孔培養(yǎng)細(xì)胞。取各濃度6個(gè)孔加入50 mmol/L的谷氨酸溶液1μL,使谷氨酸終濃度為500μmol/L,其余6個(gè)孔加入1μL PBS繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h,每組有6個(gè)副孔。向各孔加入5g/L,10μL的MTT溶液培養(yǎng)4h,然后小心吸去液體,向每孔中加入100μL DMSO,15 min后用酶標(biāo)儀在570 nm下檢測吸光度(OD值)。

    1.5 WesternBlot檢測NMDAR-1的表達(dá)將不同濃度的法舒地爾與人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)48h后,吸去上清液,用PBS洗3次,加入RIPA裂解液提取蛋白。最終蛋白上樣量為20μg,用8%分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺(SDS—PAGE)凝膠電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1h,用兔多克隆抗NMDAR-1抗體(1:400稀釋)4℃孵育過夜。TBST洗膜3次,每次5min,再將膜置入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1:10000稀釋)室溫反應(yīng)1 h。洗膜后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)法在顯影儀下顯影。Western Blot條帶應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。

    1.6 免疫熒光檢測細(xì)胞連接處NMDAR-1的表達(dá)法舒地爾培養(yǎng)細(xì)胞48h后,吸去培養(yǎng)液,用PBS洗3次。用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15min,PBS洗凈多聚甲醛后加入0.3%TritonX-100透膜15min。洗凈TritonX-100,加入正常山羊血清室溫封閉1h,再加入兔多克隆抗NMDAR-1抗體(1:200稀釋)4℃孵育過夜。吸去NMDAR-1抗體,PBS洗3次,避光加入Alexa 555標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1:500稀釋)室溫1h,PBS洗凈抗體,加入Hochest 33258(1:1000稀釋)室溫10min,用PBS洗凈細(xì)胞。封片,上機(jī)檢測。隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行NMDAR-1陽性細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。單因素方差分析(Oneway ANOVA)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較,兩組之間比較用Dunnett’t檢驗(yàn),檢測水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 不同法舒地爾濃度對膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)的影響法舒地爾培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞72h后,細(xì)胞胞體變細(xì)、變圓、變小,細(xì)胞核固縮數(shù)量增加,皺褶增多,細(xì)胞突起增多且纖細(xì),并且細(xì)胞間的連接增多。這種變化具有濃度依賴性,法舒地爾高濃度(100 μmol/L)較稍低濃度(50μmol/L)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變更加顯著,見圖1。

    2.2 谷氨酸降低經(jīng)法舒地爾處理后細(xì)胞的存活率MTT法檢測顯示,空白對照組吸光度OD值(1.47± 0.11)與空白對照+谷氨酸組(1.34±0.20)相比,無明顯變化(P>0.05);而法舒地爾50μmol/L+谷氨酸組OD值(0.66±0.15)與法舒地爾50μmol/L組OD值(0.98±0.16)相比明顯下降(P<0.05);法舒地爾100μmol/L+谷氨酸組OD值(0.49±0.17)與法舒地爾100μmol/L組OD值(0.89±0.13)相比明顯下降(P<0.05)。并且與空白對照組相比,法舒地爾50μmol/L組(P<0.05)和法舒地爾100μmol/L組的OD值明顯下降(P<0.05)。

    2.3 法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞谷氨酸受體NMDAR-1蛋白的影響經(jīng)法舒地爾100μmol/L作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h后做Western blot檢測谷氨酸受體NMDAR-1表達(dá)的變化,結(jié)果顯示:Fas 50μmol/L組相對密度為空白對照(Blank)組4.07±1.04倍(P<0.05),F(xiàn)as 100μmol/L組為4.89±0.96倍(P<0.05),見圖2。

    2.4 免疫熒光檢測高濃度法舒地爾對谷氨酸受體NMDAR-1的表達(dá)變化空白對照組(Blank)中細(xì)胞內(nèi)NMDAR-1的表達(dá)量十分低,經(jīng)法舒地爾100μmol/L(Fas 100)處理48h后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NMDAR-1的表達(dá)明顯增高,尤其是在細(xì)胞連接處的表達(dá)增高明顯。這與Western blot的結(jié)果相一致,見圖3。NMDAR-1陽性細(xì)胞百分比計(jì)數(shù)結(jié)果為:Fas 100μmol/L組79.4%±6.4%較空白對照組18.9%±3.7%明顯升高(P<0.05)。

    3 討論

    研究發(fā)現(xiàn),Rho/ROCK通路在細(xì)胞活動(dòng)如細(xì)胞骨架的重構(gòu)、細(xì)胞分化和遷徙、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[1,2,11]。ROCK(Rho kinase)的過度激活可導(dǎo)致多種疾病,ROCK的抑制能逆轉(zhuǎn)各自病理過程,因此對ROCK抑制劑的研究有著重要的意義,而法舒地爾是目前臨床上惟一可用的ROCK抑制劑。

    Rho/ROCK信號(hào)通路是膠質(zhì)瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。ROCk有兩個(gè)亞型,即ROCK 1和ROCK 2,在膠質(zhì)瘤組織中,兩者的表達(dá)較正常腦組織中高,并且ROCK 1和ROCK 2在膠質(zhì)瘤的增殖、遷移、侵襲過程中發(fā)揮著不同的作用。其中選擇性抑制ROCK 1能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和增殖,而抑制ROCK 2能加強(qiáng)抑制ROCK 1所起到的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用[12]。作為ROCK抑制劑,法舒地爾可以同時(shí)抑制ROCK 1和ROCK 2,從而發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用[4]。在本實(shí)驗(yàn)中,膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)過法舒地爾處理48h后,應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn),與對照組相比,單純法舒地爾組能夠明顯降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活率(P<0.05)。

    目前有研究表明,谷氨酸能夠通過作用于細(xì)胞膜上NMDAR引起鈣離子通道開放,鈣離子內(nèi)流使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,造成細(xì)胞凋亡[5]。作為谷氨酸信號(hào)通路中最重要的組成成分NMDAR,最初被發(fā)現(xiàn)與突觸的可塑性和記憶密切相關(guān)[13]。近期研究認(rèn)為谷氨酸相關(guān)的信號(hào)通路可能是治療腫瘤的一個(gè)新的靶點(diǎn)[6]。由于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NMDAR的表達(dá)量很低[7],因此谷氨酸無法對膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)揮興奮性毒性引發(fā)細(xì)胞凋亡。膠質(zhì)瘤細(xì)胞自身可以分泌谷氨酸使腫瘤周圍正常的膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞死亡[14],從而更好的發(fā)揮自身的侵襲性。鑒于此,如果可以誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NMDAR的表達(dá)增高,則細(xì)胞自身分泌的谷氨酸也會(huì)對本身造成殺傷,同時(shí)NMDAR也可以作為殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)。

    圖1 不同濃度法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。Blank:空白對照組;Fas 50:法舒地爾50μmol/L組;Fas 100:法舒地爾100μmol/L組。放大倍數(shù)200×,標(biāo)尺50μm

    圖2 法舒地爾對膠質(zhì)瘤細(xì)胞谷氨酸受體NMDAR-1蛋白的影響。Blank:空白對照組;Fas 50:法舒地爾50μmol/L組;Fas 100:法舒地爾100μmol/L組,n=3

    圖3 疫熒光檢測高濃度法舒地爾谷氨酸受體NMDAR-1的表達(dá)變化。Blank:空白對照組;Fas100:法舒地爾100μmol/L組,n=3

    本研究中,我們通過蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)法舒地爾處理后的NMDAR-1的表達(dá)明顯增高,并且MTT法檢測細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn),向經(jīng)法舒地爾處理后的細(xì)胞中加入谷氨酸能進(jìn)一步的降低細(xì)胞的存活率(P<0.05),而谷氨酸無法影響未經(jīng)法舒地爾處理的細(xì)胞存活率。由此我們推斷,法舒地爾能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NMDAR-1的表達(dá)增高(P<0.05),克服了NMDAR作為膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)的最大阻礙,從而可以聯(lián)合谷氨酸的興奮性毒性發(fā)揮更好的抗膠質(zhì)瘤的作用。因此,本研究結(jié)果提示,法舒地爾可以誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞谷氨酸受體的表達(dá)增高,聯(lián)合谷氨酸發(fā)揮谷氨酸興奮性毒性達(dá)到更好的抗膠質(zhì)瘤的作用,NMDAR可能是膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)之一。

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    R394.2

    A

    2014-02-25)

    (責(zé)任編輯:甘章平)

    10.3936/j.issn.1002-0152.2014.06.010

    ☆廣東省科技社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(編號(hào):2012B031800356)資助

    *中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)外科(廣州510120)

    **腫瘤科

    △中山大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室

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