浙江省急性腹瀉患兒中腸道病毒檢測(cè)分析研究

[摘要] 目的 探討浙江省急性腹瀉患兒的常見病毒組成。 方法 采集5歲以下（≤5歲）急性腹瀉患兒的811份糞便標(biāo)本，采用ELISA方法檢測(cè)A組輪狀病毒（RV），應(yīng)用多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)B/C組RV、諾如病毒（NoV）、札如病毒（SaV）、腸道腺病毒（AdV）、星狀病毒（AstV），并利用RT-PCR對(duì)RV的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行G、P分型。結(jié)果 811份糞便樣本中，RV、NoV、SaV、AdV 及AstV總的陽(yáng)性比例分別為25.52%、18.37%、4.44%、2.71%和1.23%；65份（8.01%）混合感染標(biāo)本中以RV和NoV混合感染所占比例最大（56.92%）； 116份RV的G/P分型中，G3型（37.93%）、G1型（32.75%）和P[8]型（57.76%）是RV的優(yōu)勢(shì)型別，且G3/P[8]（27.59%）是混合感染最主要的組合。結(jié)論 浙江省五種常見腹瀉病毒及其混合感染的流行狀況，為臨床治療和疾病監(jiān)測(cè)提供參考價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 腸道病毒；急性腹瀉；混合感染

[中圖分類號(hào)] R725.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）12-0109-05

急性腹瀉是世界范圍內(nèi)的一個(gè)不容忽略的公共衛(wèi)生問題，在發(fā)展中國(guó)家，每年共有兩百萬人的死亡與急性腹瀉有關(guān)，其中主要是嬰幼兒[1]。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，加之人們衛(wèi)生習(xí)慣的改善，細(xì)菌性腹瀉和寄生蟲性腹瀉感染已有所降低[2]，但是病毒性腹瀉沒有得到有效的控制。輪狀病毒（Rotavirus，RV）、諾如病毒（Norovirus，NoV）、札如病毒（Sapovirus，SaV）、腸道腺病毒（Adenovirus，AdV）、星狀病毒（Astrovirus，AstV）是引起嬰幼兒病毒性腹瀉最主要的五種病原[3]。本研究的目的是了解浙江省5歲以下門診腹瀉患兒中五種常見病毒以及混合感染的分布情況，為我國(guó)的病毒性腹瀉的防控工作提供有價(jià)值的流行病學(xué)和臨床治療的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1資料來源

本研究選取浙江省5家醫(yī)院作為監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院北侖分院、湖州市中心醫(yī)院和浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院）。隨機(jī)收集2010年1～12月期間5家哨點(diǎn)醫(yī)院門診病例中5歲以下（含5歲）急性腹瀉患兒的糞便標(biāo)本811份。標(biāo)本采集對(duì)象均符合每日排便3次或以上，且大便性狀有改變（呈水樣便、稀便）。每個(gè)患者只采集一份糞便標(biāo)本，標(biāo)本采集時(shí)間覆蓋全年各月，每周均有采集；在進(jìn)行核酸提取之前，所有標(biāo)本都儲(chǔ)存在-80℃。

1.2核酸的提取

將糞便標(biāo)本在標(biāo)本處理液（PBS液）中按1：10比例稀釋后，再以8 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，最后留取上清液于-20℃待測(cè)。取200～400 μL處理好的糞便標(biāo)本上清液，使用臺(tái)灣Geneaid 公司生產(chǎn)的商品化核酸提取試劑盒（貨號(hào)：VR100）對(duì)標(biāo)本上清液進(jìn)行核酸提取，操作方法詳見試劑盒說明書。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1 A組輪狀病毒檢測(cè)及其G、P基因分型 采用DAKO輪狀病毒ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)糞便上清液中的A組輪狀病毒，操作步驟詳見試劑盒說明書。對(duì)A組輪狀病毒陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)一步采用一個(gè)兩步擴(kuò)增的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）進(jìn)行G、P基因分型，方法同以前研究[4]。G基因分型在第一步擴(kuò)增中使用Beg9 （forward）/End9 （reverse）作為一對(duì)引物擴(kuò)增出一條1 062 bp的基因片段，該片段在第二步擴(kuò)增體系中作為鑒定G1、G2、G3、G4、G8和 G9型別的模板；P基因分型中第一步擴(kuò)增中則使用一個(gè)引物對(duì)-Con3/Con2擴(kuò)增一條876 bp的基因片段，作為第二步擴(kuò)增的模板，鑒定P[4]、P[6]、P[8]、P[9]和P[10]。

1.3.2 B/C組輪狀病毒、諾如病毒（GI和GII）、札如病毒、腸道腺病毒、星狀病毒多重PCR檢測(cè) 將提取的病毒核酸應(yīng)用隨機(jī)引物（NO： C1181， Promega， USA）合成病毒cDNA，條件為50℃逆轉(zhuǎn)錄1 h，99℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min后，然后迅速放入冰內(nèi)冷卻。然后以合成的cDNA為模板，進(jìn)行B/C組輪狀病毒、諾如病毒（GI和GII）、札如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒的多重PCR檢測(cè)。多重PCR在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括10×Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mol/L dNTP 2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，5 U/μLTaq DNA聚合酶0.125 μL，7對(duì)病毒特異性引物（表1）（各33 μmol/L，0.2 μL）的混合物，模板核酸（除腸道腺病毒為DNA，其他均為cDNA）2.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，然后在94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min條件下進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃終延伸7 min，4℃下終止反應(yīng)。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS18.0和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同組別的患者和不同病毒的感染率等變量之間的差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)采用95%的可信區(qū)間（P = 0.05），P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果

811份標(biāo)本中， 353份（43.53%）檢出一種或一種以上病毒，其中288份為單病毒感染，占35.51%（288/811），混合感染65份，占8.01%（65/811），總體來看，輪狀病毒是引起兒童腹瀉最主要的病毒，共207份標(biāo)本檢出，占25.52%（207/811），其次是諾如病毒占18.37%（147/811），札如病毒占4.44%（36/811），腸道腺病毒和星狀病毒檢出率陽(yáng)性比例較低，分別占2.71%（22/811）和1.23%（10/811）。

單病毒感染中輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、腸道腺病毒與星狀病毒的陽(yáng)性比例分別是18.4% （149/811）、 12.6% （102/811）、6.5% （23/811）、2.8% （10/811）和0.5% （4/811）。輪狀病毒是混合感染中最常見的病毒（89.23%，58/65），輪狀病毒和諾如病毒是兩兩混合感染中最常見的組合，共37例，占4.6%，其次是輪狀病毒和札如病毒混合感染，共10例（1.2%），其他兩種病毒混合感染情況的陽(yáng)性比例均小于0.5%。此外，我們還發(fā)現(xiàn)3份標(biāo)本為輪狀病毒、諾如病毒和腸道腺病毒3種病毒同時(shí)感染，1份為輪狀病毒、札如病毒和腸道腺病毒混合感染。

圖1 病毒檢測(cè)結(jié)果分布。

（A） 353例病毒檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果分布； （B） 65例混合感染分布

（RV， rotavirus； NoV， norovirus； SaV， sapovirus； AdV， adenovirus； AstV， astrovirus）.

2.2 性別和年齡分布

811例≤5 歲腹瀉患兒中，男547例，女264例，平均年齡（12.76±11.15）個(gè)月，年齡范圍1～60月齡（表2）。輪狀病毒感染平均月齡為（10.76±7.19）個(gè)月，比諾如病毒平均月齡（13.71±9.61）低（P = 0.009）。輪狀病毒在7～12月齡組患兒中陽(yáng)性比例最高，與其他年齡組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.203，P < 0.01），25～60月齡組陽(yáng)性比例（5.26%）最低；諾如病毒感染發(fā)病高峰在13～24月齡組，較其他年齡組高（χ2=8.565，P = 0.003），但是在13～24月齡組無札如病毒檢出；腸道腺病毒和星狀病毒感染全部發(fā)生于24月齡組以下兒童；混合感染中2歲以上患兒的陽(yáng)性比例較2歲以下兒童高（P < 0.01）。見表2。

2.3病毒的基因分型

206份輪狀病毒陽(yáng)性標(biāo)本中，均為A組輪狀病毒，未發(fā)現(xiàn)B和C組輪狀病毒，A組輪狀病毒標(biāo)本中的116份做了進(jìn)一步的G、P基因型鑒定，結(jié)果G3型44份（37.93%），G1型38份（32.75%），G4型6份（5.17%），G2型6份（5.17%），G9型5份（4.31%），檢出G1和G3型混合感染1份（0.86%），未確定型別16份（13.79%）；P[8]基因型 67份（57.76%），P[4] 型17份（14.66%）、P[6]型5份（4.31%）、P[10] 型2份（1.72%）和P[9]型1份（0.86%），未確定P基因型24份（20.69%）。見表3。

G、P基因型組合以P[8]G3組合為主，占27.59%（32/116），其次是P[8]G1，占16.38%（19/116），P[4]G1占6.03%，P[8]G4占5.17%。

此外，147份諾如病毒陽(yáng)性標(biāo)本包括GII基因型116份（占78.91%），G I基因型29份（占19.73 %），GI和GII型混合感染2份。

3討論

本研究較系統(tǒng)地對(duì)我國(guó)東南沿海三省門診病例中常見的5種腹瀉病毒及其混合感染情況進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。檢出任一病原陽(yáng)性標(biāo)本陽(yáng)性比例為43.5%，其中輪狀病毒（25.5%）和諾如病毒（18.4%）是導(dǎo)致兒童腹瀉最主要的兩種病毒，札如病毒為4.4%，腸道腺病毒（2.7%）和星狀病毒（1.2%）感染比例相對(duì)最低。

A組輪狀病毒是感染急性腹瀉的最主要病原，且經(jīng)常引起兒童的嚴(yán)重腹瀉，輪狀病毒根據(jù)不同的抗原和遺傳特性分為A～G共7組，其中A、B、C組與人類感染有關(guān)[4]。諾如病毒在流行性和散發(fā)性腹瀉中都扮演著重要角色，并且在各年齡組都能引起病毒性腹瀉的發(fā)生[5]，但目前為止還沒有能治療諾如病毒性腹瀉的方法。札如病毒能夠在5歲以下兒童病例中引起小規(guī)模的流行，但癥狀往往比諾如病毒的輕[6]。近年的研究表明，腸道腺病毒能夠增加免疫力低下人群的腹瀉發(fā)病率，并能夠延長(zhǎng)患者住院時(shí)間[2]。星狀病毒則被證實(shí)是引起兒童、老年人以及免疫力低下患者的重要感染病原之一[3]。

我國(guó)以5歲以下兒童為基礎(chǔ)的RV腹瀉監(jiān)測(cè)網(wǎng)全年系統(tǒng)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，中國(guó)門診腹瀉患兒的RV中位陽(yáng)性比例為29%（范圍：15%～35%）[4]，本次監(jiān)測(cè)結(jié)果與之相符，其中A組輪狀病毒是門診腹瀉患兒感染最多的病原。研究表明，輪狀病毒流行毒株在不同年份、不同地區(qū)存在差異[4，7]，G1、G2、G3、G4毒株和P[8]為感染人類的主要型別，我國(guó)近年來的的優(yōu)勢(shì)毒株為G3型和P[8]型。本次研究G分型結(jié)果顯示， G3比例最高，占37.9%，但G1的比例達(dá)到了32.75%，接近G3，提示G1的感染和G3同樣重要。近些年，G9型輪狀病毒已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)一種常見的毒株[2-4，7]，我國(guó)5歲以下住院兒童G9的感染率為4%[4]，而本次門診病例的監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)G9的感染率達(dá)到4.3%，提示在我國(guó)，無論是住院還是門診患兒G9型的監(jiān)測(cè)都有重要的意義。P 分型中，P [8] 型最多，占57.8%，其他型別比例較少，尤其值得注意的是，我們還分離到2株P(guān)[10]基因型標(biāo)本，占1.7%（2/116），這是該地區(qū)的首次報(bào)道。之前的文獻(xiàn)報(bào)道各種G、P 型組合的分布具有較大的差異[4，8]，本次監(jiān)測(cè)中以G3P [8]組合為主（27.59%），其次是G1P [8] （16.4%），G1P [4] （6.0%） 和G4P [8] （5.2%），應(yīng)該提出的是，G2P[4]作為世界上四種常見的組合之一[9]。在本研究中僅占2.6%。另外，近年來一些國(guó)家和地區(qū)出現(xiàn)了一些既往少見型別如G5、G6、G8、G10和G12以及一些不常見的組合[10]。這些輪狀病毒流行株的不斷變化意味著輪狀病毒抗原之間存在廣泛的變異性，提示持續(xù)不斷地監(jiān)測(cè)輪狀病毒的分子流行病學(xué)變化能夠?yàn)檠芯枯啝畈《镜貐^(qū)間的傳播關(guān)系、闡明毒株的地理分布提供科學(xué)依據(jù)。

據(jù)全國(guó)病毒性腹瀉監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)對(duì)我國(guó)11個(gè)省份5歲以下腹瀉兒童的監(jiān)測(cè)，我國(guó)2007年諾如病毒陽(yáng)性比例大約為15%，和往年基本一致。東南沿海地區(qū)為諾如病毒高發(fā)區(qū)[11，12]，曾玫等2010年對(duì)我國(guó)五所城市的醫(yī)院門診腹瀉患兒連續(xù)一年的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果我國(guó)東南部城市上海、杭州和廣州的門診病例中諾如病毒陽(yáng)性比例分別為14.9%、20.0%和17.9%，三個(gè)地區(qū)總陽(yáng)性比例為17.6%（494/2804）[13，14]。我們的結(jié)果（陽(yáng)性比例為18.4%）與以上的研究結(jié)果接近，但高于國(guó)內(nèi)住院患兒諾如病毒感染率（大約8.9%～10.3%）[11-13]；和一些發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我們的結(jié)果偏高，如美國(guó)7.4%和日本13.2%[15，16]?？赡芘c以下因素有關(guān)：首先，諾如病毒主要經(jīng)糞-口傳播，通過污染的水源和食物、空氣以及人與人的直接接觸傳播，甚至有報(bào)道廣泛污染的環(huán)境表面也可能在諾如病毒爆發(fā)中起著重要的作用[13-15]，作為一個(gè)發(fā)展中國(guó)家，我國(guó)的衛(wèi)生條件較發(fā)達(dá)國(guó)家差距較大，為諾如病毒的傳播提供了有利的條件。另外，諾如病毒常在人口聚集區(qū)引起集體暴發(fā)，而據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)東南部的人口密度達(dá)到了362.8人/平方公里（人口基數(shù)來源于2008年底），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他國(guó)家和地區(qū)，成為諾如病毒感染的另一有利條件。

諾如病毒GII基因型比GI 型更為流行[14]，本研究中GII基因型占絕大部分78.9%，GI 型僅占19.7%，與Blanton LH等研究結(jié)果較吻合[17]，他們利用RT-PCR方法進(jìn)行諾如病毒分型，結(jié)果GII基因型占79%，GI 型占19%。與諾如病毒研究相比，國(guó)內(nèi)關(guān)于札如病毒系統(tǒng)的流行病學(xué)研究比較少，針對(duì)門診病例的研究更是缺乏。札如病毒感染在世界范圍內(nèi)均有分布，感染率為0.3%～9.3%[18，19]。我國(guó)蘭州地區(qū)2003～2007年住院患兒急性腹瀉患兒陽(yáng)性率為1.13%，而中國(guó)疾控中心對(duì)我國(guó)九省市住院患兒札如病毒流行情況的調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)急性腹瀉患兒札如病毒總陽(yáng)性比例僅為0.9%，明顯低于國(guó)外研究。我們的研究結(jié)果（4.4%）與之較為接近，但比國(guó)內(nèi)住院患兒感染率高，并且也超過腸道腺病毒（2.71%）與星狀病毒（1.23%）成為我國(guó)東南沿海門診病例中第三位的重要病毒?？赡苁且?yàn)樵绮《疽鸬母篂a癥狀輕，且有自限性[20，21]。腺病毒和星狀病毒則易引起重型腹瀉從而導(dǎo)致患兒住院治療[2， 21]。我國(guó)應(yīng)該加強(qiáng)以門診或社區(qū)為單位的監(jiān)測(cè)，以求能更合理地反映我國(guó)札如病毒的疾病負(fù)擔(dān)。

本次監(jiān)測(cè)結(jié)果中混合感染情況復(fù)雜，多達(dá)9種組合，陽(yáng)性比例達(dá)到8.0%。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)了4份（0.5%，4/811）標(biāo)本為3種病毒混合感染，其中3份為輪狀病毒、諾如病毒和腸道腺病毒混合感染，1份為輪狀病毒、札如病毒和腸道腺病毒感染。近年來，3種病毒同時(shí)感染的現(xiàn)象在其他不同的研究中也不斷地被報(bào)道出來，而且組合的種類越來越多[4， 22]。雖然病毒之間的相互組合對(duì)疾病嚴(yán)重程度是否有增強(qiáng)作用尚存爭(zhēng)議，但是混合感染的存在已經(jīng)是一個(gè)不容忽視的問題[23]。以上結(jié)果告訴我們一方面要加強(qiáng)病毒性腹瀉中混合感染情況的監(jiān)測(cè)，另一方面也要重視開展涉及病原范圍更廣（包括細(xì)菌、病毒、甚至寄生蟲）的流行病學(xué)以及臨床病理學(xué)研究，以更好地了解我國(guó)急性感染性腹瀉的本地資料。

五種病毒及其混合感染均無性別差異。病毒性腹瀉高發(fā)年齡是7～24月齡，2歲以下患兒占95.5%（337/353）。國(guó)內(nèi)外研究提示2歲以下兒童是輪狀病毒和諾如病毒的易感人群[4，23，24]，本研究中輪狀病毒以7～24月齡感染率（21.1%）最高，高于1～6月齡（15.0%）和25～60月齡（5.3%），該結(jié)論一方面支持了母體抗體對(duì)輪狀病毒感染具有保護(hù)作用的觀點(diǎn)，另一方面也提示2周歲以下的低齡兒童應(yīng)為輪狀病毒疫苗的施治的重點(diǎn)人群。通過比較發(fā)現(xiàn)，輪狀病毒感染平均月齡為（10.76±7.19）個(gè)月，小于諾如病毒平均月齡（13.71±9.61）個(gè)月（P = 0.009），說明兒童中諾如病毒感染年齡比輪狀病毒感染年齡偏大[20]。既往的研究顯示札如病毒腹瀉發(fā)病年齡主要在5歲以下[21]，本次研究中未發(fā)現(xiàn)7～12月齡患兒，其他各年齡組之間陽(yáng)性比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腸道腺病毒感染全部發(fā)生在2歲以下的兒童中，一方面，該結(jié)果可能是受到了2歲以上有限的監(jiān)測(cè)病例（僅有57例，占7.0%）的影響，從而與真實(shí)情況存在偏差，且星狀病毒感染也全部發(fā)生在2歲以下的兒童中。2歲以上兒童較2歲以下兒童混合感染率高（P < 0.001），能否說明兒童中高年齡組易發(fā)混合感染有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

總之，這是第一次在我國(guó)東南地區(qū)開展的多中心的同時(shí)利用ELISA和多重PCR技術(shù)對(duì)門診病例中病毒性腹瀉患兒的病原學(xué)監(jiān)測(cè)，不僅清晰地說明了我國(guó)東南地區(qū)五種常見腹瀉病毒及其混合感染的流行狀況，而且科學(xué)地闡明我國(guó)病毒性腹瀉的流行規(guī)律、發(fā)病狀況和疾病負(fù)擔(dān)，為臨床進(jìn)一步研究提供了必需的本地資料。為了更加準(zhǔn)確地了解我國(guó)病毒性腹瀉的疾病負(fù)擔(dān)以及有針對(duì)性地開發(fā)、改進(jìn)疫苗，長(zhǎng)期和廣泛的監(jiān)測(cè)研究是十分必要的。

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（收稿日期：2013-03-18）