丹參提取物764—3對高氧損傷后新生大鼠腦細(xì)胞凋亡以及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

[摘要] 目的 探討抗氧化劑丹參提取物764-3對高氧損傷后新生大鼠腦細(xì)胞凋亡和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)的影響。 方法 采用Spraque-Dawley（SD）新生大鼠持續(xù)暴露于≥90%高氧14 d建立高氧腦損傷模型，分別用764-3進(jìn)行預(yù)防和治療干預(yù)后，采用HE染色對比腦細(xì)胞病理變化，SABC免疫組化法檢測VEGF表達(dá)水平以及脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡標(biāo)記法（TUNEL）檢測腦細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 高氧對照組與空氣對照組相比：可見神經(jīng)元變性，VEGF表達(dá)下降，凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）增多。干預(yù)組14 d與高氧對照組14 d相比：764-3預(yù)防組VEGF表達(dá)高于高氧對照組，但差異無顯著性（P>0.05），764-3治療組VEGF表達(dá)顯著高于高氧對照組（P<0.05），兩干預(yù)組間差異無顯著性（P>0.05）。兩干預(yù)組凋亡指數(shù)均明顯下降且差異顯著（P<0.01），764-3治療組顯著低于預(yù)防組（P<0.01）。結(jié)論 764-3可通過上調(diào)腦組織中VEGF的表達(dá)來抑制腦細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞凋亡；VEGF；高氧癥；腦損傷；丹參提取物

[中圖分類號(hào)] R651.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）28-0016-03

隨著NICU的發(fā)展，越來越多的超低體重兒得以存活。由于早產(chǎn)，他們的肺極不成熟，使氧療和機(jī)械通氣成為必不可少的搶救措施。但高氧復(fù)蘇亦可造成新生兒腦損傷，且已逐漸引起重視，然而其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，一般認(rèn)為是與氧自由基引起的腦脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。因此研究高氧腦損傷保護(hù)劑是國內(nèi)外一直關(guān)注的課題，有效而低毒性的神經(jīng)保護(hù)劑是中西醫(yī)共同追求的目標(biāo)。764-3是中藥抗氧化劑丹參的提取物，具有一個(gè)含雙鍵的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對組織的氧化損傷有一定的保護(hù)作用[1]。本文通過檢測經(jīng)764-3處理過的高氧損傷后的新生大鼠腦細(xì)胞凋亡指數(shù)和VEGF的表達(dá)水平，以評(píng)價(jià)764-3在防治高氧腦損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型及分組

將清潔級(jí)SD雌雄大鼠（由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）按3∶1合籠交配，生后6 h內(nèi)置設(shè)定的≥90%高氧艙或空氣艙中（由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），艙內(nèi)控制溫度25℃～26℃，濕度60%～70%。高氧腦損傷模型的建立參照Felderhoff-mueser U[2]和Peiser C[3]等建立的模型。每天開箱約1 h用于添加飼料及更換墊料，并且讓空氣組和高氧組母鼠每天更換，以防母鼠氧中毒影響哺乳。新生鼠共分為4大組，分別為空氣對照組（Ⅰ組）、高氧對照組（Ⅱ組）、764-3預(yù)防組（Ⅲ組）、764-3治療組（Ⅳ組）。Ⅰ組和Ⅱ組為對照組，取7 d和14 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，研究高氧暴露造成腦損傷的時(shí)間依從性，Ⅲ組和Ⅳ組為干預(yù)組，取14 d一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，研究764-3的預(yù)防和治療作用。每小組新生鼠數(shù)目調(diào)整在8～9只之間，共6小組（空氣對照組7 d， 空氣對照組14 d， 高氧對照組7 d， 高氧對照組14 d，764-3預(yù)防組14 d， 764-3治療組14 d）49只新生大鼠。Ⅲ組于生后第1～7 天注射藥物；Ⅳ組于生后第8～14 天注射藥物；每日晨起定時(shí)給藥。有學(xué)者[2]發(fā)現(xiàn)，新生鼠高氧腦損傷的最敏感時(shí)期為生后1周以內(nèi)，故將1～7 d干預(yù)組稱為預(yù)防組，將8～14 d干預(yù)組作為治療組。用藥劑量：丹參（764-3，購自天津血液研究所）為40 mg/（kg·d）。

1.2 組織標(biāo)本的制備

Ⅰ組和Ⅱ組分別在生后滿7 d、14 d，Ⅲ組和Ⅳ組在生后滿14 d予10%水合氯醛腹腔麻醉后，取出腦組織，立即置于4%多聚甲醛固定液中，常規(guī)石蠟包埋，取海馬水平做冠狀切片，厚度為5 μm，用于HE染色、免疫組化和TUNEL檢測。

1.3 指標(biāo)檢測方法

1.3.1 HE染色 腦組織切片常規(guī)蘇木素伊紅染色，光鏡下觀察腦組織病理變化。

1.3.2 SABC免疫組化法 兔抗鼠VEGF多克隆抗體（一抗）和配套使用的SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，按SABC免疫組化標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行操作。結(jié)果為半定量統(tǒng)計(jì)，依據(jù)染色程度和著色比例進(jìn)行。染色程度：無染色為0；輕度為1；中度為2；重度為3。著色比例：未見為0；<1/4為1；1/4～1/2為2；>1/2為3，綜合兩種分?jǐn)?shù)。在400倍光鏡下，每例觀察10個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分，取平均值為本例評(píng)分，陰性為2分以下， 陽性為2分以上。

1.3.3 TUNEL染色 采用德國Roche公司生產(chǎn)的TUNEL試劑盒進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)中以細(xì)胞核染成棕黃色的為陽性細(xì)胞，在400倍光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野中500個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，以平均每100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)作為凋亡指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

VEGF表達(dá)以陽性或陰性表達(dá)為標(biāo)記，各組間比較采用Fisher確切概率法，而凋亡指數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，總體差異采用方差分析，組間比較采用兩兩檢驗(yàn)。采用SPSS13統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦HE染色

空氣對照組光鏡下偶見細(xì)胞變性，高氧組可見較多變性神經(jīng)元，表現(xiàn)為胞漿呈粉紅色的均勻嗜酸性染色，細(xì)胞固縮，細(xì)胞核部分深染，核仁不清。7 d組主要集中在大腦皮層，呈灶狀、層狀改變。外側(cè)較為明顯，至14 d時(shí)，海馬區(qū)、齒狀回被累及，損傷程度較7 d時(shí)有所加重。小腦病變不明顯，見圖1～2。使用764-3干預(yù)后病變明顯減少。

2.2 免疫組化染色（VEGF表達(dá)檢測結(jié)果）

空氣對照組VEGF大量表達(dá)，部位主要分布在海馬、皮質(zhì)以及皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)，其中皮質(zhì)下區(qū)表達(dá)最多。高氧對照組VEGF表達(dá)低于空氣對照組，7 d時(shí)差異無顯著性（P>0.05），14 d時(shí)差異顯著（P<0.01）。經(jīng)764-3干預(yù)后，預(yù)防組VEGF表達(dá)增高，但差異無顯著性（P>0.05），治療組VEGF表達(dá)則顯著增高（P<0.05），兩干預(yù)組間差異無顯著性（P>0.05），見表1、表3以及圖3～6。

2.3 凋亡指數(shù)

如表2所示，高氧7 d對照組凋亡指數(shù)顯著高于對應(yīng)的空氣對照組（t′=37.71，P<0.01），至14 d時(shí)進(jìn)一步增多（t′=18.39，P<0.01）。高氧7 d對照組凋亡細(xì)胞重點(diǎn)分布在大腦皮層，至14 d時(shí)，海馬區(qū)、齒狀回被累及。相比與高氧對照組，764-3干預(yù)組凋亡指數(shù)明顯下降（F=45.38，P<0.01），其中764-3預(yù)防組（t′=41.93，P<0.01），764-3治療組（t′=20.65，P<0.01），764-3治療組顯著低于預(yù)防組（t′=50.27，P<0.01）。見表2、3及圖7～10。

2.4 VEGF與凋亡指數(shù)的關(guān)系

將參與本次實(shí)驗(yàn)的764-3干預(yù)組和7 d、14 d的高氧對照組大鼠共4組33只，分別按VEGF表達(dá)陰性（19只）和陽性（14只）分為二組來統(tǒng)計(jì)凋亡指數(shù)，可以看出VEGF表達(dá)陽性組凋亡指數(shù)為16.31±12.25較低，VEGF表達(dá)陰性組凋亡指數(shù)為39.56±19.13則較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t′=5.41，P<0.01）。見表4。

3 討論

高氧對新生兒發(fā)育影響的研究目前主要集中在肺損傷和視網(wǎng)膜損傷上，對腦發(fā)育影響的報(bào)道甚少。嚙齒類動(dòng)物出生后2周以內(nèi)處于腦的快速發(fā)育期，大約相當(dāng)于人類6個(gè)月胎兒至生后3歲幼兒，是對非生理氧毒性的敏感時(shí)期[2]。故本研究采用足月新生大鼠腦模型作為人類早產(chǎn)兒腦發(fā)育的研究基礎(chǔ)，建立高氧腦損傷模型，旨在明確高氧對新生兒期腦發(fā)育影響的損傷機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)臨床防治工作。本實(shí)驗(yàn)采用7 d和14 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，研究高氧對腦細(xì)胞損傷的時(shí)間依從性。從HE染色和TUNEL研究結(jié)果來看，高氧對照組腦細(xì)胞水腫變性和凋亡細(xì)胞明顯增多（P<0.01），7 d以前主要集中在大腦皮層，7 d以后損傷范圍隨吸氧時(shí)間延長而增大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高氧對腦細(xì)胞有損傷作用，且隨高氧暴露時(shí)間延長而逐漸加重。而凋亡細(xì)胞的區(qū)域性分布則提示高氧對腦細(xì)胞的損傷具有一定的部位選擇性，以上結(jié)果警示臨床醫(yī)師在使用高氧治療新生兒疾病時(shí)應(yīng)慎重，盡量減少吸入時(shí)間以避免對患兒造成氧損傷。

研究發(fā)現(xiàn)高氧對照組7 d VEGF表達(dá)低于空氣對照組，但無顯著差異（P>0.05）；至14 d時(shí)VEGF表達(dá)明顯低于空氣對照組（P<0.01），提示長時(shí)間持續(xù)吸入高氧可造成腦組織VEGF表達(dá)減少。Nabeyrat E等[4]報(bào)道，高氧通過抑制CDK2-cyclinE活性和激活P21基因表達(dá)，使血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ增殖和分化受到抑制，可能是暴露于高氧過程中組織VEGF表達(dá)減少的關(guān)鍵因素。VEGF作為一種特異性的促內(nèi)皮增殖的生長因子，除了具有促進(jìn)新生血管形成、改善缺血部位的作用以外，還有直接保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[5]。因此我們推論高氧造成腦損傷的一條途徑是通過減少VEGF的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)提示及時(shí)補(bǔ)充VEGF可以用來治療高氧腦損傷，為臨床治療提供了新思路。使用764-3干預(yù)后，VEGF的表達(dá)有了不同程度的上升。764-3預(yù)防組高于高氧對照組，但差異無顯著性（P>0.05），764-3治療組VEGF的表達(dá)顯著高于高氧對照組（P<0.05），提示早期使用764-3不能顯著提高VEGF的表達(dá)水平，但在損傷后期給予764-3可以有效地提高VEGF的表達(dá)水平。

764-3具有抗氧化、抗炎、抗凝等多種功效，其抗氧化作用較顯著，又有Ca2+拮抗劑作用，可減少氧自由基的產(chǎn)生，從實(shí)驗(yàn)中可以看出干預(yù)組的凋亡指數(shù)較高氧對照組明顯減少（P<0.01），提示早期使用764-3可以有效地延緩高氧腦損傷，后期使用764-3可以有效地修復(fù)腦損傷，進(jìn)一步證實(shí)了764-3對腦細(xì)胞的保護(hù)作用。其中治療組的凋亡指數(shù)顯著低于預(yù)防組，提示764-3的神經(jīng)保護(hù)作用重點(diǎn)體現(xiàn)在治療作用上，推測可能是與7～14 d是氧自由基產(chǎn)生的高峰期[6]以及764-3具有較強(qiáng)的組織修復(fù)作用有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。蔣一茵等[7]發(fā)現(xiàn)764-3能夠顯著提升高氧損傷后新生大鼠肺組織SOD含量，降低肺細(xì)胞凋亡指數(shù)從而發(fā)揮保護(hù)作用。王建社等[8]發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參具有下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞nNOS、iNOS表達(dá)，減少NO生成，抑制細(xì)胞凋亡，減輕缺血再灌注對大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用。總之764-3可以通過多種途徑減少細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮保護(hù)作用。

另外我們發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)陽性組凋亡指數(shù)低，VEGF表達(dá)陰性組凋亡指數(shù)則較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示VEGF可以顯著減少細(xì)胞凋亡。Zachary I等[9]發(fā)現(xiàn)VEGF可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，姜曙等[10]發(fā)現(xiàn)VEGF可以通過VEGF受體對星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。近年來發(fā)現(xiàn)VEGF具有直接的神經(jīng)保護(hù)作用。冀紅等[11]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充外源性VEGF可以減少新生鼠缺血缺氧性腦損傷造成的腦細(xì)胞凋亡。周旋等[12]發(fā)現(xiàn)VEGF-C對大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞的凋亡有保護(hù)作用。推測764-3可以通過提高VEGF的表達(dá)來減少腦細(xì)胞凋亡，從而減輕高氧對腦細(xì)胞的損傷。VEGF制劑已經(jīng)用于臨床治療，但價(jià)格昂貴，推廣受限，而764-3可以顯著提高VEGF的表達(dá)，且資源豐富，價(jià)格相對較低，更符合我國國情。

綜上所述：此次試驗(yàn)提示（1）高氧對腦細(xì)胞的損傷具有時(shí)間依從性和部位選擇性；（2）高氧造成新生大鼠腦損傷的一種機(jī)制可能是通過降低VEGF表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的；764-3緩解高氧腦損傷的一種機(jī)制可能是通過上調(diào)VEGF的表達(dá)來抑制腦細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的；（3）764-3的保護(hù)作用重點(diǎn)體現(xiàn)在治療作用上。764-3是我國傳統(tǒng)中藥丹參的提取物，它價(jià)格低廉，來源廣泛，其研究將具有廣泛前景。但本次研究只采用了單劑量實(shí)驗(yàn)，而且就764-3抗腦損傷的研究比較表淺，故還有待于進(jìn)一步深入研究其機(jī)制及合適的劑量，為臨床用藥提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2013-07-02）