miR—200c在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

[摘要] 目的 研究miR-200c在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)并探討其臨床意義。方法 收集肝細(xì)胞癌手術(shù)組織標(biāo)本52例，30例癌旁正常組織作為對照，采用qRT-PCR檢測肝細(xì)胞癌組織及對照組織中miR-200c的表達(dá)情況，分析miR-200c表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果 肝細(xì)胞癌組織中miR-200c平均表達(dá)量明顯低于癌旁對照組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癌旁對照組織中miR-200c平均表達(dá)量約為肝細(xì)胞癌的2.90倍。miR-200c的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌惡性程度、腫瘤分化程度以及AFP表達(dá)有關(guān)，miR-200c的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者年齡、性別、HBsAg、腫瘤大小、是否合并肝硬化等無關(guān)。多元Logistic回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤大（OR=2.44，95%CI：1.22～10.36）、血清AFP 高（OR=2.39，95%CI：1.78～5.34）、腫瘤分化程度低（OR=3.08，95%CI： 2.29～6.03）是肝癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論 miR-200c與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、臨床進(jìn)展密切相關(guān)，它可能是肝細(xì)胞癌新的潛在的治療靶點(diǎn)及診斷預(yù)后分子標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞癌；miR-200c；臨床進(jìn)展

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）28-0001-03

miRNA 是一種包含21～25 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA。miRNA由高等生物基因組編碼，通過5’端被稱為種子序列的7 nt序列與位于靶mRNA 3’UTR的 miRNA調(diào)控元件相互作用，識別靶mRNA，引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯，從而參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動[1-4]。研究表明，miR-200c在乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[5-6]。miRNA-200c通過抑制ZEB1來增強(qiáng)RASSF1A表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的表皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程[7]。這些結(jié)果提示，miR-200c表達(dá)下調(diào)可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。但目前miR-200c在肝細(xì)胞癌的生物學(xué)功能并不清楚。本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測miR-200c在肝細(xì)胞癌組織與癌旁對照組織中表達(dá)情況，并探討miR-200c與肝細(xì)胞癌臨床分期、轉(zhuǎn)移等臨床參數(shù)之間的關(guān)系，從而為進(jìn)一步揭示肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制和尋找新的診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

52例肝細(xì)胞癌標(biāo)本均取自于郴州市人民醫(yī)院2009年1月～2011年10月肝細(xì)胞癌患者手術(shù)標(biāo)本和30例癌旁對照標(biāo)本（距離癌組織邊緣3cm以外），組織立即置于液氮保存。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)為肝細(xì)胞癌。手術(shù)前未接受化療，且獲得患者知情同意書。

1.2 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄

常規(guī)Trizol試劑抽提總RNA，無酶水溶解沉淀。紫外分光光度計(jì)測定RNA提取液的A260及A280吸光度值，檢測RNA純度和濃度。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按轉(zhuǎn)錄miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海吉瑪生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系：5×RT緩沖液4 μL、1 μmol/L miRNA特異性RT引物1.2 μL、25 mmol/L鎂離子3 μL、10 mmol/L dNTP 0.75 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑 0.25 μL、200 U/μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.2 μL、RNA 1 μg，用無酶水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。

1.3 定量PCR檢測

采用SYBR方法，應(yīng)用Biorad公司的定量PCR儀 IQ5進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×PCR緩沖液10 μL、5 μmol/L miRNA特異性PCR引物0.4 μL、 RT產(chǎn)物1 μL、5 U/μL Taq酶 0.2 μL、無酶水加至20 μL。反應(yīng)條件： 95℃3 min，95℃ 12 s、62℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-200c的相對表達(dá)量通過公式2-△Ct計(jì)算，其中，△Ct=miR-200c平均Ct值-U6平均Ct值[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。miR-200c表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)進(jìn)行Logistic回歸分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肝細(xì)胞癌組織中miR-200c表達(dá)明顯下調(diào)

提取52例肝細(xì)胞癌組織以及30例癌旁對照組織總RNA，運(yùn)用qRT-PCR檢測miR-200c肝細(xì)胞癌組織及癌旁對照組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與癌旁對照組織相比，miR-200c在肝細(xì)胞癌組織表達(dá)普遍下調(diào)。肝細(xì)胞癌組織中miR-200c平均表達(dá)量明顯低于癌旁對照組織，分別為（0.54±0.04）、（1.06±0.06），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），肝細(xì)胞癌組織miR-200c平均表達(dá)量約為癌旁對照組織中的0.51倍。

2.2 miR-200c表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

如表1所示， miR-200c下調(diào)表達(dá)程度與肝細(xì)胞癌惡性程度、腫瘤分化程度以及AFP有關(guān)，miR-200c的表達(dá)隨著臨床分期增加而下調(diào)，分化程度越差的肝細(xì)胞癌組織中的miR-200c的表達(dá)越低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；且miR-200c的表達(dá)與AFP相關(guān)，AFP表達(dá)高的肝細(xì)胞癌組織中的miR-200c表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；此外，miR-200c的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者年齡、性別、HBsAg、腫瘤大小、是否合并肝硬化等無關(guān)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的多元Logistic回歸模型

把單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的影響因素納入多元Logistic回歸模型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小（OR=2.44，95%CI： 1.22～10.36）、血清AFP 高（OR=2.39，95%CI：1.78～5.34）、腫瘤分化程度低（OR=3.08，95%CI：2.29～6.03）、TNM 分期高（OR=3.69，95%CI：0.25～0.63）是肝癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。具體見表2。

3 討論

肝細(xì)胞癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，即人們平常所說的肝癌指的多數(shù)為原發(fā)性肝癌。其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中，位列第三位，僅次于胃癌和食管癌。我國每年約有11萬人死于肝癌。是此病的高發(fā)區(qū)，已成為嚴(yán)重威脅人民健康的重大疾病，值得我們重視[8]，其患病率占全世界的50%以上。對于肝癌的治療包括手術(shù)治療、肝動脈栓塞治療、放射治療、局部治療、全身化療、生物和免疫治療、中醫(yī)治療、綜合治療和并發(fā)癥的治療等。手術(shù)治療是治療肝癌的主要方法，在手術(shù)切除或化療、放療殺滅大量癌細(xì)胞后，應(yīng)用生物和免疫治療可鞏固和增強(qiáng)療效，國內(nèi)外現(xiàn)在多用基因重組細(xì)胞因子和細(xì)胞因子激活的細(xì)胞進(jìn)行過繼免疫治療。這些都是通過激活體內(nèi)殺傷細(xì)胞起攻擊腫瘤細(xì)胞的作用，從而可以延緩腫瘤的進(jìn)展，延長患者的生存期[9]。導(dǎo)致目前肝癌這種局面的主要原因有三：一是肝癌發(fā)病隱匿，早期無任何癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)患者處于晚期，失去了根治的時(shí)機(jī)；二是肝癌對現(xiàn)有的化療藥物和放射治療均不太敏感，除了手術(shù)和一些物理治療外，可供選擇的有效治療方法有限；三是患者治療（如手術(shù)）后復(fù)發(fā)和肝外轉(zhuǎn)移率高。因此，腫瘤研究者一直致力于尋找肝癌治療的靶點(diǎn)。

miRNA成為分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)，人類miRNA充當(dāng)瘤基因或抑瘤基因的作用調(diào)控mRNA的表達(dá)及相關(guān)信號通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，至少30%以上的蛋白編碼基因受miRNA調(diào)節(jié)，它廣泛參與了包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、早期胚胎發(fā)育以及應(yīng)激反應(yīng)等生命活動中的重要過程[10，11]，同時(shí)，它的表達(dá)改變也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用。與編碼蛋白的基因一樣，不編碼的miRNA在疾病發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)行為表現(xiàn)為類似抑制疾病發(fā)展的基因樣的作用[12-15]。本文運(yùn)用qRT-PCR首次檢測miR-200c在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，并分析其臨床意義。結(jié)果顯示與癌旁對照組織相比，miR-200c在肝細(xì)胞癌組織表達(dá)明顯下調(diào)；miR-200c下調(diào)表達(dá)程度與肝細(xì)胞癌惡性程度、腫瘤分化程度、AFP水平有關(guān)，miR-200c的表達(dá)隨著臨床分期增加而下調(diào)，分化程度越差的肝細(xì)胞癌組織中的miR-200c的表達(dá)越低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們的結(jié)果顯示miR-200c在肝細(xì)胞癌與癌旁對照組織存在表達(dá)差異，其表達(dá)水平與患者臨床進(jìn)展及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，多元Logistic回歸模型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤大、血清AFP 高、腫瘤分化程度低、TNM 分期高是肝癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明miR-200c可能作為抑癌基因參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，并且可能成為肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后判斷新一代腫瘤分子標(biāo)志物及肝細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)。當(dāng)然日后仍需大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證?？傊?，闡明miR-200c在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用對于認(rèn)識肝癌發(fā)生的機(jī)制，探索新的有效的肝細(xì)胞癌診斷預(yù)后評價(jià)標(biāo)志物及治療方法，具有重要的科學(xué)意義。

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（收稿日期：2013-06-21）