吉林省漢族154例正常人HLA-Cw及KIR基因型頻率的分析

韓 瑜 焦立新 馬 寧 趙 令 姜振宇②

(長春市中心血站，長春130031)

殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like recepor，KIR)是表達(dá)于 NK細(xì)胞和部分活化T細(xì)胞的表面的糖蛋白［1］。KIR分為兩大類:刺激性KIR(sKIR)和抑制性KIR(iKIR)。

HLA-Cw廣泛分布于人體組織細(xì)胞，可被KIR特異性識別，參與調(diào)控NK細(xì)胞殺傷功能，是NK細(xì)胞賴以識別自我與非我的分子基礎(chǔ)之一。同一HLA-Cw分子與不同的KIR結(jié)合后，可以產(chǎn)生不同的信號，激活或抑制NK細(xì)胞的殺傷功能［2］。觀察表明，個(gè)體的HLA-Cw與其sKIR或iKIR的組合形式存在差異，這種差異不但可以影響對疾病的易感性，還可以影響疾病的進(jìn)展［3，4］。為了解中國人不同地區(qū)HLA-Cw與KIR的識別方式，我們應(yīng)用PCRSSP技術(shù)，檢測了154例長期居住于吉林地區(qū)的漢族健康人的KIR及其HLA-Cw配體的基因型頻率，分析HLA-Cw與KIR受體在吉林地區(qū)的識別情況，為今后研究其在人群遺傳學(xué)和它在疾病中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 154名吉林漢族健康人，均系長期居住于吉林省長春地區(qū)，其祖輩三代以上均系漢族。男84名，女70名;年齡21～50歲，均為無血緣關(guān)系的無償獻(xiàn)血者。征其同意后抽取外周靜脈血5 ml，放于含有EDTA抗凝劑試管，保存-80℃冰箱備用。

1.2 基因組DNA提取 采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒，按照試劑盒的操作說明書進(jìn)行基因組DNA的提取。DNA濃度≥80 mg/L，純度為A260/280=1.65～1.90之間。

1.3 引物合成 參照文獻(xiàn)［5］方法合成擴(kuò)增 KIR基因的 PCR-SSP分型法引物(表1)，反應(yīng)1～15的內(nèi)對照引物為 FGH(5'-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3')和RGH(5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3')，擴(kuò)增產(chǎn)物長度429 bp;反應(yīng)16的內(nèi)對照引物為DRB1-F(5'-TGCCAAGTGGAGCACCCAA-3')，DRB1-R(5'-GCATCTTGCTCTGTGCAGAT-3')擴(kuò)增產(chǎn)物長度796 bp。HLA-Cw基因的PCR-SSP分型法的引物參照文獻(xiàn)［6］，引物見表2。所有引物均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成，并經(jīng)過Blast驗(yàn)證。

1.4 KIR基因及其HLA-Cw的PCR-SSP分型 各KIR基因均采用兩對KIR基因上下游引物加一對內(nèi)對照引物體系，而HLA-Cw基因采用上下游引物加一對內(nèi)對照引物體系。

1.4.1 PCR-SSP分型法擴(kuò)增KIR基因 PCR-SSP反應(yīng)體系及循環(huán)條件參照文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行。

1.4.2 PCR-SSP分型法擴(kuò)增HLA-Cw基因 PCRSSP反應(yīng)體系及循環(huán)條件參照文獻(xiàn)［6］方法進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析參照文獻(xiàn)［5］方法，HLA-Cw與KIR在吉林漢族人群中的出現(xiàn)頻率和基因型頻率。KIR基因出現(xiàn)頻率(F)通過直接計(jì)數(shù)測得，pf(%)=陽性基因數(shù)/研究組總?cè)藬?shù);KIR 基因頻率的計(jì)算公式:

2 結(jié)果

2.1 KIR基因的電泳結(jié)果 KIR基因常規(guī)擴(kuò)增后經(jīng)電泳分析，結(jié)果顯示目的片段的大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。反應(yīng)孔1 ～14，16的內(nèi)對照為 GH，片段長度429 bp;反應(yīng)孔15的內(nèi)對照DRB1片段長度796 bp。

表1 KIR引物序列Tab.1 Primers used for KIR genotyping by PCR-SSP

表2 HLA-Cw引物序列Tab.2 Primers used for HLA-Cw genotyping by PCR-SSP

圖1 KIR基因的PCR-SSP分型結(jié)果Fig.1 The results of KIR genotyping by PCR-SSP

圖2 HLA-Cw基因的PCR-SSP分型結(jié)果Fig.2 The results of HLA-Cw genotyping by PCR-SSP

2.2 HLA-Cw基因的電泳結(jié)果 HLA-Cw基因常規(guī)擴(kuò)增后經(jīng)電泳分析，結(jié)果顯示:目的片段的大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。反應(yīng)孔 C1、C2的內(nèi)對照為GH，片段長度429 bp。

2.3 HLA-Cw與KIR在吉林漢族人群中的出現(xiàn)型和基因型頻率。兩者的結(jié)果見表3。

2.4 HLA-Cw與KIR的識別情況 KIR分為兩大類:刺激性KIR(sKIR)和抑制性KIR(iKIR)。抑制基因KIR2DL1、2DL2和2DL3的配體是HLA-C。根據(jù)結(jié)合重鏈80號位點(diǎn)氨基酸的不同，HLA-C又分為兩組。80號位點(diǎn)是天冬氨酸的為HLA-C2組;80號位點(diǎn)是賴氨酸的為HLA-C1組。KIR 2DL1的配體是 HLA-C2，KIR2DL2/2DL3的配體是HLA-C1［7］。

HLA-C1Asn80的表達(dá)頻率為79.87%，遠(yuǎn)高于HLA-C2Lys80的表達(dá)頻率27.92%。表4顯示了HLACw與KIR刺激性配對和抑制性配對的組合在吉林漢族人群中的分布。HLA-C2Lys80+2DL1的組合頻率最高為27.27%，其次分別HLA-C1Asn80+2DL2/2DL3為 68.83%，2DS2+HLA-C1Asn80為 9.74%，2DS1+HLA-C2Lys80為9.74%。分別有72.08%和21.43%的觀察對象表達(dá)KIR2DL1、KIR2DS1而無相應(yīng)HLA-Cw表達(dá);21.43%的個(gè)體表達(dá)KIR2DS1而不表達(dá)HLA-Cwlys-KIR2DL1配對。2.60% 的個(gè)體表達(dá)KIR2DS2而不表達(dá)HLA-Cwasn-KIR2DL2/L3配對。

表3 HLA-Cw與KIR在吉林漢族人群中的表現(xiàn)型和基因型頻率Tab.3 Phenotype and genotype frequency of KIR and HLA-Cw of Jilin Han population

表4 HLA-Cw與KIR刺激性配對和抑制性配對的組合在吉林漢族人群中的分布Tab.4 The combined frequencies of diffencent compound KIR-HLA genetypes in Jilin Han population

3 討論

KIR通過識別人類白細(xì)胞抗原HLA-Ⅰ 類分子調(diào)控效應(yīng)細(xì)胞活性，啟動(dòng)免疫過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌。KIR的配體主要為HLA-Ⅰ類抗原，不同的KIR受體識別不同的HLA，并進(jìn)一步判別對象屬于“自我”或“非我”，從而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用［8，9］。

NK細(xì)胞能夠識別被病毒感染的組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，通過細(xì)胞毒作用裂解靶細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，因此它構(gòu)成了人體免疫系統(tǒng)的第一道屏障［10，11］。不成熟的NK細(xì)胞經(jīng)過主要組織相容性復(fù)合體HLA-I類分子的“教育”才能變?yōu)槌墒斓?NK細(xì)胞［12］。NK細(xì)胞通過其膜表面的抑制受體和活化受體精確的調(diào)整其功能狀態(tài)。在長期的進(jìn)化過程中，KIR和HLA共同進(jìn)化，相互選擇逐步形成現(xiàn)在高效和精確的受/配體系統(tǒng)［13］。最近，Kouyuki等［14］在對477例瘧疾患者的研究中發(fā)現(xiàn)腦型瘧疾患者中的KIR2DL3基因和其配體HLA-C1的組合與非腦型瘧疾患者相比較有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。進(jìn)一步的研究更是發(fā)現(xiàn)KIR2DL3-HLA-C1的組合形式在瘧疾高發(fā)人群中保持著較低的頻率。

由此可見，KIR和HLA的受/配體系統(tǒng)在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能方面發(fā)揮著重要的作用，因此，確定HLA-Cw與KIR的識別情況就顯得尤為重要。我們在對吉林漢族人群154例個(gè)體進(jìn)行KIR及HLA-Cw分型結(jié)果顯示，HLA-C1Asn80的表達(dá)頻率為79.87%，低于廣東漢族的97.5%和伊朗人群的76%［6，15］。吉林漢族HLA-C2Lys80的表達(dá)頻率27.92%與廣東漢族人群的頻率相當(dāng)［15］，但是都低于伊朗人群的頻率［6］。廣東漢族人 群 的 HLA-C1Asn80的頻率為97.5%［15］，遠(yuǎn)高于吉林漢族的79.87%。吉林漢族人群KIR受體和其配體的組合頻率與其它地區(qū)人群比較基本相同，吉林漢族人群KIR2DS2+HLAC1Asn80的頻率為9.74%，低于廣東漢族14%和中東的伊朗的 21.5%［6，15］。而吉林漢族人群 HLA-C1 C1Asn80+KIR2DL2/2DL3的頻率為68.83%，高于廣東漢族的41.8%和中東伊朗的6.5%［6，15］。這些可能是由于HLA和KIR的種族和地區(qū)差異所造成。

在對吉林漢族人群的154例個(gè)體研究中，我們還發(fā)現(xiàn)有9.74%和9.74%的個(gè)體僅表達(dá)2DS2+HLAC1Asn80和2DS1+HLA-C2Lys80的活化性受配體對組合。對于這些個(gè)體，由于抑制信號不能完全阻斷活化信號的傳遞，因此此類個(gè)體的NK細(xì)胞可能攻擊自身的組織細(xì)胞，產(chǎn)生自身免疫性疾病［4］。這還有待于今后更多大樣本實(shí)驗(yàn)和臨床患者實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。

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