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    CD123+CD11c-pDC在初發(fā)類風濕關節(jié)炎患者外周血及關節(jié)液中的表達①

    2013-11-28 02:04:02胡永瑋劉盼盼杜文靜
    中國免疫學雜志 2013年8期
    關鍵詞:抗人樹突百分率

    羅 莉 胡永瑋 劉盼盼 吉 鵬 杜文靜

    (新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕科,烏魯木齊830054)

    類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性對稱性炎癥性多關節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病,其發(fā)生、發(fā)展與多種誘發(fā)因素及機體免疫紊亂相關,其中抗原提呈功能異常是重要的一部分。樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)是目前所知功能最強大的抗原提呈細胞,通過起始機體免疫應答,誘發(fā)免疫耐受等參與免疫反應。CD123+CD11c-是淋巴系來源的樹突狀細胞的標記分子[1],CD123+CD11c-樹突狀細胞在RA中的免疫作用已受到關注,但目前研究較少。我們擬通過測定RA患者外周血及關節(jié)液中pDC的表達水平,探討其在RA發(fā)病機制中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象及主要試劑

    1.1.1 研究對象 RA組:30例類風濕關節(jié)炎患者,均來自新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕科住院患者,符合1987年美國風濕病學會(ACR)修訂的RA診斷標準。所有患者均符合RA活動指標:晨僵時間>1小時,腫脹關節(jié)數(shù)>4個,壓痛關節(jié)數(shù)>5個,紅細胞沉降率(ESR)>28 mm/h,C反應蛋白(CRP)>8 mg/L。研究納入患者均為初次發(fā)病,就診前未用過緩解病情抗風濕藥或激素類藥物。其中男性4例,女性26例,年齡25~63歲,平均(47±4.9)歲,OA組:選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕科住院患者,符合美國風濕病協(xié)會制定的骨關節(jié)炎診斷標準,其中男性5人,女性20人。排除其他風濕性疾病。健康對照組:本院職工健康志愿者25人,男性5人,女性20人,體檢各項指標均在正常范圍內,與RA組在年齡和性別上均匹配。

    1.1.2 主要試劑 2011年試驗所用試劑:FITC標記的抗人MHCⅡ;PE標記的抗人CD123;PE-cy7標記的抗人CD11c以及同型對照抗體均購自BD/Pharmingen公司(Becton Dickinson/PharMingen USA)。紅細胞裂解液購自Beckman Coulter公司。2012年試驗所用試劑:FITC標記的抗人Lineage 2;PE標記的抗人CD123;PerCP-Cy5.5標記的MHCⅡ;PE-cy7標記的抗人CD11c以及同型對照抗體均購自BD/Pharmingen公司(Becton Dickinson/PharMingen USA)。紅細胞裂解液購自Beckman Coulter公司。

    1.1.3 主要儀器 流式細胞儀(BD LSRⅡ,USA);離心機 Centrifuge 5810R(Effendorf,Germany)。

    1.2 免疫熒光標記和流式細胞術檢測 收集患者及對照組外周抗凝血及關節(jié)積液100 μl,分別加入FITC標記的抗人 MHCⅡ抗體,PE標記的抗人CD123抗體,PE-cy7標記的抗人CD11c抗體各20 μl;或 FITC標記的抗人 Lineage 2抗體;PE標記的抗人CD123抗體;PerCP-Cy5.5標記的MHCⅡ抗體;PE-cy7標記的抗人CD11c抗體各20 μl;同型對照管100 μl抗凝血中分別加入同型對照20 μl。室溫避光孵育30分鐘,加入紅細胞裂解液500 μl,PBS洗滌2次,離心后棄上清,然后再加入100 μl FACS緩沖液重懸細胞置于流式細胞儀上檢測。使用美國BD公司的LSRⅡ流式細胞儀,按規(guī)程操作。

    1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)以±s表示,根據(jù)方差齊性檢驗結果,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,不同指標之間進行Spearman相關分析。

    2 結果

    2.1 RA組與OA組及健康對照組外周血CD123+CD11c-pDC細胞百分率比較 RA組外周血CD123+CD11c-pDC 細胞百分率(1.69% ±0.97%)低于 OA組(5.38% ±2.31%)及健康對照組(5.63% ±2.33%),差異分別有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1,圖1。

    表1 RA組與OA組及健康對照組外周血中pDC百分率比較(±s,%)Tab.1 pDC percentage in peripheral blood of RA group,OA group and control group(±s,%)

    表1 RA組與OA組及健康對照組外周血中pDC百分率比較(±s,%)Tab.1 pDC percentage in peripheral blood of RA group,OA group and control group(±s,%)

    Note:Compared to OA group,1)P <0.05;compared to control group,2)P >0.05;compared to RA group,3)P <0.05.

    Groups n Perpheral blood RA 30 1.69% ±0.97%1)OA 25 5.38% ±2.31%2)Control 25 5.63% ±2.33%3)

    圖1 流式細胞術檢測RA組與對照組外周血中pDC細胞百分率的表達Fig.1 Expressing of individual pDC percentage in the peripheral blood control and RA patients

    表2 RA組與OA組關節(jié)液中pDC百分率比較(±s,%)Tab.2 pDC percentage in synovial fluid of RA group and OA group(±s,%)

    表2 RA組與OA組關節(jié)液中pDC百分率比較(±s,%)Tab.2 pDC percentage in synovial fluid of RA group and OA group(±s,%)

    Note:Compared to OA group,1)P >0.05.

    Groups n Synovial fluid RA 30 3.63% ±2.7%1)OA 25 1.84% ±1.67%

    2.2 OA組和健康對照組外周血CD123+CD11cpDC細胞百分率比較 OA組外周血CD123+CD11c-pDC 細胞百分率(5.38% ±2.31%)低于健康對照組(5.63% ±2.33%),差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05),見表1。

    2.3 RA組與OA組關節(jié)液CD123+CD11c-pDC細胞百分率比較 RA組關節(jié)液CD123+CD11c-pDC細胞百分率(3.63% ±2.7%)高于對照組(1.84% ±1.67%),差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05),見表2。

    2.3 RA患者外周血pDC百分率與臨床指標的相關性分析 利用統(tǒng)計軟件對RA患者外周血及關節(jié)液pDC細胞百分率與臨床指標進行相關性分析,兩者與疾病DAS28評分無相關性,與疾病活動度指標ESR、CRP和RF亦無相關性。

    3 討論

    類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種常見的自身免疫性疾病,在全世界約有1%的人患有此病。其特點是以關節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性炎性反應,滑膜炎持久反復發(fā)作,導致關節(jié)內軟骨和骨質破壞,關節(jié)功能障礙,終致殘廢。其發(fā)病機制尚不十分明確,發(fā)病機理復雜,目前認為主要以細胞免疫為主,單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞、活化T細胞通過多種途徑影響滑膜細胞和淋巴細胞的增殖和分化,促進滑膜細胞和軟骨細胞合成并釋放炎癥介質,引發(fā)滑膜的炎性反應、軟骨基質的崩解,造成關節(jié)損傷[2]。樹突狀細胞是其中功能強大的抗原提呈細胞,近年研究發(fā)現(xiàn)DC在RA中誘導初始T細胞分化為Th1細胞或Th2細胞,調節(jié)Th1/Th2的平衡、在不同成熟狀態(tài)誘導T細胞產(chǎn)生促炎或抑炎因子參與細胞免疫。還可誘導T細胞依賴或非依賴性B細胞向漿細胞分化,調節(jié)自身抗體生成,參與部分體液免疫[3]。

    人DC的來源可分為兩個亞群:骨髓系來源的樹突狀細胞(Myeloid dendritic cell,mDc),高表達CD11c,低表達CD123;淋巴系來源的漿細胞樣樹突狀細胞(pDC),高表達 CD123,不表達CD11c等髓系標記[1]。國外研究者在人類扁桃體中發(fā)現(xiàn)表達CD4+CD3-CD11c-的細胞出現(xiàn)在 T細胞聚集區(qū)[4,5],但不表達 T細胞受體。進一步發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)似淋巴樣,類漿細胞樣,在 IL-3或 IL-3聯(lián)合CD40L刺激下可分化為成熟的樹突狀細胞。而CD123為DC細胞表面IL-3受體α鏈,在人pDC高表達。因此推測表達CD123但不表達CD11c的DC為不成熟pDC。故本實驗中CD123+CD11c-標記的DC為不成熟狀態(tài)的pDC。

    Sarah L Jongbloed等[6]報道稱RA患者外周血及關節(jié)液中pDC均處在不成熟狀態(tài),關節(jié)液較外周血細胞更為幼稚。未成熟pDC可誘導T細胞失能,有研究發(fā)現(xiàn)自身免疫性硬化病中存在對拓撲異構酶I特異性反應的CD4+T細胞,當這些CD4+細胞與用該酶沖擊過的人外周血未成熟pDC培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞失能,不能對特異抗原刺激表現(xiàn)出增殖反應,對B細胞自身抗體協(xié)同刺激作用消失。結果提示外周不成熟pDC可誘導自身CD4+T細胞介導免疫反應無應答[7]。經(jīng)IL-3及CD40L刺激后,pDC可誘導幼稚型T細胞分化為CD8+調節(jié)性T細胞,促進Th2生成并分泌IL-4、IL-5、IL-10,抑制炎癥反應[8]。本實驗中RA組外周血pDC較對照組有顯著下降,這與Christophe Richez等人[3]的研究結果一致。推測在外周血中CD123+CD11c-pDC數(shù)量減少,其誘導失能及抑制性免疫作用減弱,相對促進全身免疫反應。故實驗結果提示RA患者體內存在細胞免疫功能的紊亂。

    Roberto Lande等[9]發(fā)現(xiàn)RA患者關節(jié)液存在抑制pDC成熟的細胞因子,且在Lin-CD123++pDC表面發(fā)現(xiàn)表達下調細胞成熟的BDCA2,提示關節(jié)液中pDC也處于不成熟狀態(tài)。唐蓓[10]發(fā)現(xiàn)在DC成熟過程中,MHCⅡ表達增高,并表達協(xié)同刺激分子CD80、CD86、CD40。Jongbloed 等[6]分離 RA 患者關節(jié)液中pDC,并經(jīng)CpG ODN2216刺激后發(fā)現(xiàn)其高表達CD80、CD83及CCR7,刺激成熟后的pDC釋放大量IFN-ɑ和TNF-ɑ,IL-10參與免疫反應。而僅IL-3刺激pDC不能表達成熟標記。本實驗中測定關節(jié)液中CD123+CD11c-pDC含量較對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。推測關節(jié)液中CD123+CD11c-pDC未經(jīng)刺激成熟,其產(chǎn)生釋放細胞因子能力弱,在關節(jié)炎癥反應中不是主要調節(jié)細胞,在RA疾病進展中不是扮演主要角色。而本實驗中還發(fā)現(xiàn)RA組外周血及關節(jié)液中pDC含量與DSA28評分,疾病活動指標均無相關性,進一步闡釋CD123+CD11c-pDC與RA疾病發(fā)展缺乏相關性。

    本研究中入組患者均為初發(fā)RA患者,未經(jīng)藥物治療,體內免疫狀態(tài)為初始狀態(tài),無藥物干擾,故實驗測定指標較為準確。研究結果提示CD123+CD11c-pDC在RA外周血中含量降低,免疫耐受能力減弱,相對促進全身炎癥反應。為進一步明確pDC在類風濕關節(jié)炎患者靶器官的相關聯(lián)系,我們計劃測定不同成熟狀態(tài)pDC及相關細胞因子、轉錄因子、信號傳導途徑等變化,深入分析pDC在類風濕關節(jié)炎中的作用機制。

    1 Lebre M C,Tak P P.Dendritic cell subsets:Their roles in rheumatoid arthritis[J].Acta Reumatol Port,2008;33:35-45.

    2 Feldmann M,Bmnnan F M,F(xiàn)oxwen B M et al.The role of TNF-alpha and IL-1 in the rheumatoid arthritis[J].Curt Dir Autoimmun,2001;3(2):188-199.

    3 Christophe Richez,Schaeverbeke T,Dumoulin C et al.Myeloid dendritic cells correlate with clinical response whereas plasmacytoid dendritic cells impact autoantibody development in rheumatoid arthritis patients treated with infliximab[J].Arthritis Research & Therapy,2009;11:100-113.

    4 Liu Y J.IPC:professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors [J].Annu Rev Immunol,2005;23:275-306.

    5 Grouard G,Rissoan M C,F(xiàn)ilgueira L et al.The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin(IL)-3 and CD40-ligand[J].J Exp Med,1997;185:1101-1111.

    6 Jongbloed S L,Lebre M C,F(xiàn)raser A R et al.Enumeration and phenotypical analysis of distinct dendritic cell subsets in psoriatic arthritis and rheumatoid arthritis[J]Arthritis Research & Therapy,2006;8:R15 doi:10.1186-1864.

    7 Kuwana M,Kaburaki J,Wright T M et al.Induction of antigen specific human CD4+T cell anergy by peripheral blood DC2 precursors[J].Eur J Immunol,2001;31(9):2547-2557.

    8 Rissoan M C,Soumelis V,Kadowaki N et al.Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation.[J]Science,1999;283:1183-1186.

    9 Roberto Lande,Elena Giacomini,Barbara Serafini et al.Characterization and recruitment of plasmacytoid dendritic cells in synovial fluid and tissue of patients with chronic inflammatory arthritis[J]Immunol,2004;173:2815-2824.

    10 唐 蓓.LPS介導的樹突狀細胞成熟過程中的表型變化[J].中國免疫學雜志,2012;28(2):114-121.

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